Rendimiento de cuatro ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para identificar el SARS-CoV-2 en Etiopía

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Desde el brote de la enfermedad por coronavirus (COVID-19) de 2019, se han desarrollado muchas pruebas comerciales de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) en todo el mundo y se han convertido en ensayos estándar.Aunque varias pruebas se desarrollaron rápidamente y se aplicaron a las pruebas de diagnóstico de laboratorio, el rendimiento de estas pruebas no se ha evaluado en una variedad de entornos.Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento de los ensayos Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI y Sansure Biotech utilizando el estándar de referencia compuesto (CRS).El estudio se realizó en el Instituto de Salud Pública de Etiopía (EPHI) del 1 al 30 de diciembre de 2020. Se extrajeron 164 muestras nasofaríngeas utilizando el mini kit QIAamp RNA y el sistema de preparación de muestras de ADN Abbott.De 164 muestras, el 59,1 % fueron positivas y el 40,9 % negativas para CRS. La positividad de Sansure Biotech fue significativamente baja en comparación con CRS (p < 0,05). La positividad de Sansure Biotech fue significativamente baja en comparación con CRS (p < 0,05). Los resultados de Sansure Biotech se compararon con los resultados de CRS (p < 0,05). Los resultados positivos de Sansure Biotech fueron significativamente más bajos que los de CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05)。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05)。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech obtuvo significativamente menos resultados positivos en comparación con CRS (p < 0,05).La concordancia general de los cuatro análisis fue del 96,3 al 100 % en comparación con CRS.Además de la baja tasa de positividad del ensayo Sansure Biotech, el rendimiento de los cuatro ensayos fue casi comparable.Como tal, el ensayo Sansure Biotech [Solo para investigación (RUO)] requiere una validación adicional para su uso en Etiopía.Finalmente, se debe considerar la investigación adicional para evaluar los ensayos con las afirmaciones apropiadas del fabricante.
Las pruebas de laboratorio son parte del Plan Estratégico de Preparación y Respuesta (SPRP) de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19).La OMS advierte que los países deben desarrollar la capacidad de laboratorio para mejorar la preparación, el manejo adecuado de casos, la vigilancia y la respuesta rápida a los desafíos de salud pública.Esto sugiere que el papel del laboratorio es clave para caracterizar la enfermedad y la epidemiología de los agentes infecciosos emergentes y controlar su propagación.
El diagnóstico de COVID-19 requiere información epidemiológica y médica, síntomas/signos personales y datos radiográficos y de laboratorio2.Desde que se informó del brote de COVID-19 en Wuhan, China, se han desarrollado muchas pruebas comerciales de amplificación de ácido nucleico (NAAT) en todo el mundo.La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) se ha utilizado como método de rutina y estándar para el diagnóstico de laboratorio de la infección por el síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2)3.La detección molecular del SARS-CoV-2 generalmente se basa en los genes N (gen de la proteína de la nucleocápside), E (gen de la proteína de la envoltura) y RdRp (gen de la polimerasa de ARN dependiente de ARN) en ORF1a/b (marco de lectura abierto 1a/b) .gen) región identificada a partir del genoma viral.Se consideran las principales regiones conservadas que se encuentran en los genomas virales para el reconocimiento de virus4.Entre estos genes, los genes RdRp y E tienen una alta sensibilidad analítica de detección, mientras que el gen N tiene una baja sensibilidad analítica5.
El rendimiento de los ensayos de PCR puede variar según varios factores, como: reactivos de extracción, reactivos de amplificación/detección, método de extracción, calidad de la máquina de PCR y otros instrumentos.Hasta abril de 2020, más de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nueve países han recibido la Autorización de uso de emergencia (EUA) para el diagnóstico de COVID-196.En Etiopía, se utilizan más de 14 plataformas PCR en tiempo real para la detección PCR del SARS-CoV-2 en 26 instituciones de salud pública, incluidas ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 y Quant-studio7.Además, hay varios kits de prueba de PCR disponibles, como la prueba Daan Gene, la prueba Abbott SARS-CoV-2, la prueba Sansure Biotech y la prueba SARS-CoV-2 BGI.Aunque la rRT-PCR es muy sensible, algunos pacientes con COVID-19 informan resultados falsos negativos debido a copias insuficientes de ácido ribonucleico (ARN) viral en las muestras debido a la recolección, el transporte, el almacenamiento y la manipulación y las pruebas de laboratorio inadecuados.condiciones y acciones del personal8.Además, el mal manejo de muestras o controles, la configuración del umbral del ciclo (Ct) y la reactividad cruzada con otros ácidos nucleicos patógenos o ARN del SARS-CoV-2 inactivo/residual pueden generar resultados falsos positivos en los ensayos rRT-PCR9.Por lo tanto, está claro que las pruebas de PCR sí pueden identificar portadores de fragmentos de genes, ya que ni siquiera pueden distinguir entre genes virales verdaderamente activos, por lo que las pruebas solo pueden identificar portadores y no pacientes10.Por ello, es importante evaluar el rendimiento diagnóstico mediante métodos estándar en nuestro medio.Aunque muchos reactivos NAAT están disponibles en el Instituto de Salud Pública de Etiopía (EPHI) y en todo el país, aún no se ha informado una evaluación comparativa de su eficacia.Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento comparativo de los kits disponibles comercialmente para la detección de SARS-CoV-2 por rRT-PCR utilizando muestras clínicas.
En este estudio se incluyeron un total de 164 participantes con sospecha de COVID-19.La mayoría de las muestras procedían de centros de tratamiento (118/164 = 72 %), mientras que los 46 participantes restantes (28 %) procedían de centros sin tratamiento.Entre los participantes no atendidos en el centro, 15 (9,1%) tenían casos clínicamente sospechosos y 31 (18,9%) tenían contactos de casos confirmados.Noventa y tres (56,7%) participantes eran hombres y la edad media (± SD) de los participantes fue de 31,10 (± 11,82) años.
En este estudio, se determinaron las tasas positivas y negativas de cuatro pruebas para COVID-19.Por lo tanto, las tasas positivas del ensayo Abbott SARS-CoV-2, el ensayo Daan Gene 2019-nCoV, el ensayo SARS-CoV-2 BGI y el ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV fueron del 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % y 55,5 %, respectivamente. .Las puntuaciones del estándar de referencia compuesto (CRS) positivo y negativo fueron 97 (59,1 %) y 67 (40,9 %), respectivamente (Tabla 1).En este estudio, la definición de CRS se basó en la regla "cualquier positivo", según la cual, de cuatro resultados de prueba, dos o más resultados de prueba que dieron el mismo resultado se consideraron verdaderos positivos o negativos.
En este estudio, encontramos un porcentaje de acuerdo negativo (NPA) del 100 % (95 % IC 94,6–100) para todos los análisis en comparación con CRS.El análisis de Sansure Biotechnology mostró una PPA mínima del 93,8 % (95 % IC 87,2-97,1) y el análisis Daan Gene 2019-nCoV tuvo una concordancia general del 99,4 % (95 % IC 96,6-99,9).Por el contrario, la concordancia general entre el ensayo SARS-CoV-2 BGI y el ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV fue del 98,8 % y el 96,3 %, respectivamente (Tabla 2).
El coeficiente de concordancia kappa de Cohen entre los resultados del ensayo CRS y Abbott SARS-CoV-2 fue totalmente consistente (K = 1,00).De manera similar, los valores kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI y Sansure Biotech 2019-nCoV también son totalmente consistentes con CRS (K ≥ 0.925).En este análisis comparativo, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró que los resultados del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV fueron significativamente diferentes de los resultados de CRS (p = 0,031) (Tabla 2).
Como se muestra en la figura.1, el porcentaje del valor Ct más bajo (< 20 Ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp y N combinado) fue del 87,6 % y el valor Ct del gen ORF1a/b del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de bajo El valor de Ct (< 20 Ct) fue del 50,3% y el valor de Ct alto (36-40 Ct) fue del 3,2%. 1, el porcentaje del valor Ct más bajo (< 20 Ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp y N combinado) fue del 87,6 % y el valor Ct del gen ORF1a/b del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de bajo El valor de Ct (< 20 Ct) fue del 50,3% y el valor de Ct alto (36-40 Ct) fue del 3,2%.Como se muestra en la figura.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, el porcentaje del análisis del valor Ct más bajo (< 20 Ct) de Abbott SARS-CoV-2 (gen combinado RdRp y N) fue del 87,6 %, y el valor Ct del análisis del gen ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de valor de Ct bajo (< 20 Ct) representó el 50,3%, y el valor de Ct alto (36-40 Ct) representó el 3,2%.如 图 1 所 示 ， Abbott Sars-Cov-2 检测 （结合 RDRP 和 N 基因） 的 最 低 CT 值 百分比 （（<20 CT） 为 87.6%， Sansure Biotech 2019-Ncov 检测 的 的 的 的 的 的 的 基因 值 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低 低值(< 20 Ct) 的百分比为50,3 %，高Ct 值(36–40 Ct) 的百分比为3,2 %。 Como se muestra en la Figura 1, el porcentaje de valor Ct más bajo (< 20 Ct) de la prueba Abbott SARS-CoV-2 (combinación de los genes RdRp y N) es 87,6 %, el valor Ct del gen ORF1a/b de la prueba Sansure Biotech 2019-nCoV muestra un porcentaje bajo de Ct值(< 20 Ct) 的 es 50,3 %, 高Ct 值(36–40 Ct) 的 el porcentaje es 3,2 %. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019 - Анализ nCoV показал низкий Ct. Como se muestra en la Figura 1, el ensayo Abbott SARS-CoV-2 (que combina los genes RdRp y N) tuvo el valor de Ct porcentual más bajo (< 20 Ct) con un 87,6 %, mientras que el valor de Ct del gen ORF1a/b en el Sansure Estudio Biotech 2019: el análisis de nCoV mostró un Ct bajo. Процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. El porcentaje de valores (< 20 Ct) fue del 50,3%, y el porcentaje de valores altos de Ct (36-40 Ct) fue del 3,2%.La prueba Abbott SARS-CoV-2 B registró valores de Ct superiores a 30. Por otro lado, en el ensayo BGI SARS-CoV-2, el gen ORF1a/b tenía un valor de Ct alto (> 36 Ct), el porcentaje era del 4% (Fig. 1). Por otro lado, en el ensayo BGI SARS-CoV-2, el gen ORF1a/b tenía un valor de Ct alto (> 36 Ct), el porcentaje era del 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составли % (1). Por otro lado, en el análisis de BGI el gen ORF1a/b del SARS-CoV-2 presentaba un valor de Ct elevado (> 36 Ct), cuyo porcentaje era del 4% (fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Por otro lado, en la detección de BGI SARS-CoV-2, el porcentaje del gen ORF1a/b con valor alto de Ct (>36 Ct) es del 4% (Figura 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4 % (рис. 1). Por otro lado, en el análisis BGI SARS-CoV-2, el porcentaje de genes ORF1a/b con valores altos de Ct (>36 Ct) fue del 4% (fig. 1).
En este estudio, tomamos 164 muestras nasofaríngeas.Para todos los tipos de ensayos, el aislamiento y la amplificación del ARN se realizaron utilizando los métodos y kits recomendados por los respectivos fabricantes.
Este estudio demostró que la prueba de Abbott para el SARS-CoV-2 tiene el mismo rendimiento de detección que el CRS, con un 100 % de concordancia positiva, negativa y general.El acuerdo kappa de Cohen es 1,00, lo que indica un acuerdo total con CRS.Un estudio similar de la Universidad de Washington en los EE. UU. encontró que la sensibilidad y especificidad general de la prueba de Abbott para el SARS-CoV-2 fue del 93 % y del 100 %, respectivamente, en comparación con el ensayo determinado por laboratorio (LDA) de los CDC. .11. El sistema de detección de Abbott SARS-CoV-2 se basa en la detección combinada simultánea de los genes N y RdRp, ya que ambos genes son más sensibles, minimizando los falsos negativos12.Un estudio en Viena, Austria, también mostró que los grandes volúmenes de muestra de extracción y los volúmenes de eluyente de detección minimizan los efectos de dilución y aumentan la eficiencia de detección13.Por lo tanto, la combinación perfecta de Abbott para el ensayo SARS-CoV-2 se puede asociar con un sistema de detección de plataforma que detecta simultáneamente genes combinatorios, extrae una gran cantidad de muestras (0,5 ml) y utiliza una gran cantidad de eluyente (40 µl).
Nuestros resultados también mostraron que el rendimiento de detección de la prueba genética Daan fue casi el mismo que el de CRS.Esto es consistente con un estudio14 realizado en la Universidad de Anhui en Huainan, China, y la afirmación del fabricante de un 100 % de acuerdo positivo.A pesar de los informes de resultados consistentes, una muestra resultó falsamente negativa después de volver a analizar el mismo eluato, pero resultó positiva en los ensayos Abbott SARS-CoV-2 y Sansure Biotech nCoV-2019.Esto sugiere que puede haber variabilidad en los resultados entre diferentes tipos de ensayos. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo Daan Gene fue significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con su ensayo de referencia definido en el laboratorio. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo Daan Gene fue significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con su ensayo de referencia definido en el laboratorio. Тее не менее, в исследовании, проведенentar Sin embargo, en un estudio en China15, el resultado del análisis de Daan Gene fue significativamente diferente (p < 0,05) del análisis de referencia de su laboratorio.0.05 p<0,05 <0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Sin embargo, en un estudio en China15, los resultados de la prueba genética de Daan fueron significativamente diferentes (p < 0,05) en comparación con su prueba de laboratorio de referencia.Esta discrepancia puede deberse a la sensibilidad de la prueba de referencia para detectar el SARS-CoV-2, y es posible que sea importante realizar más estudios para determinar la causa.
Además, nuestro estudio evaluó el rendimiento comparativo del ensayo SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un excelente acuerdo porcentual positivo (PPA = 97,9%), acuerdo porcentual negativo (NPA = 100%) y acuerdo porcentual general por género ( OPA).).= 98,8%).Los valores de Kappa de Cohen mostraron buena concordancia (K = 0,975).Los estudios en los Países Bajos16 y China15 han mostrado resultados consistentes.La prueba SARS-CoV-2 BGI es una prueba de detección de un solo gen (ORF1a/b) que utiliza 10 µl de eluato de amplificación/detección.A pesar de la buena concordancia estadística con nuestros resultados de referencia, el análisis omitió dos muestras positivas (1,22 %) de la muestra total.Esto puede tener enormes implicaciones clínicas para la dinámica de transmisión tanto a nivel del paciente como de la comunidad.
Otro análisis comparativo incluido en este estudio fue el ensayo Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO);el porcentaje global de coincidencias fue del 96,3%.La fuerza del acuerdo también fue determinada por el valor Kappa de Cohen, que fue de 0,925, lo que indica un acuerdo total con el CRS.Una vez más, nuestros resultados son idénticos a los estudios realizados en la Universidad Central del Sur en Changsha, China, y en el Departamento de Laboratorio Clínico del Hospital Popular de Liuzhou, ciudad de Liuzhou, China17. Aunque se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo Sansure Biotech ha tenido una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (p < 0,005). Aunque se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo Sansure Biotech ha tenido una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Aunque se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró que el resultado del ensayo Sansure Biotech tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el CRS (p < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 的 统计 一致性 ， 但 卡方 检验 （Macnemar 检验） 表明 ， Sansure Biotech 检测 的 与 与 CRS 相比 具有 统计学 显着 （（P <0.005）。。。。。。。。。。。。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致 性 ， 但 检验 （（Macnemar 检验 表明 ， ， Sansure Biotech 检测 结果 与 CRS 相比 具有 显着 （（P <0.005 。。。。。。。。。。。。。。。。 。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. A pesar de la buena concordancia estadística mencionada anteriormente, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,005) entre el ensayo Sansure Biotech y el CRS.Seis muestras (3,66 %) resultaron ser falsos negativos en comparación con CRS (Tabla complementaria 1);esto es muy importante, especialmente dada la dinámica de transmisión del virus.Los datos anteriores también respaldan esta baja tasa de detección15.
En este estudio, se determinaron los valores de Ct para cada ensayo y plataforma respectiva, con el valor de Ct medio más bajo informado en el ensayo Abbott SARS-CoV-2.Este resultado puede estar relacionado con el sistema de pruebas genéticas combinadas simultáneas de Abbott para la detección del SARS-CoV-2.Por lo tanto, según la Figura 1, el 87,6 % de los resultados de Abbott SARS-CoV-2 tenían valores de Ct inferiores a 20. Solo una pequeña cantidad de resultados de muestras (12,4 %) estaban en el rango de 20-30.No se registraron valores de Ct superiores a 30.Además del uso de Abbott del formato de prueba genética del panel SARS-CoV-2, este resultado puede estar relacionado con el límite inferior de detección (32,5 copias de ARN/mL)18, que es tres veces inferior al límite inferior de la empresa de 100 copias de ARN. /mL.ml) 19.
Este estudio tiene algunas limitaciones: en primer lugar, no contamos con métodos estándar/de referencia [como la carga viral u otras pruebas de laboratorio (LDA)] por falta de recursos.En segundo lugar, todas las muestras utilizadas en este estudio eran hisopos nasofaríngeos, mientras que los resultados no eran aplicables a otros tipos de muestras y, en tercer lugar, el tamaño de nuestra muestra era pequeño.
Este estudio comparó el rendimiento de cuatro ensayos de rRT-PCR para el SARS-CoV-2 utilizando muestras nasofaríngeas.Todos los ensayos de detección tuvieron un rendimiento casi comparable, con la excepción del ensayo Sansure Biotech. Además, se identificó la baja tasa de positividad en el ensayo Sansure Biotech en comparación con el CRS (p < 0,05). Además, se identificó la baja tasa de positividad en el ensayo Sansure Biotech en comparación con el CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов сравнению с CRS (p < 0,05). Además, la prueba Sansure Biotech mostró un bajo porcentaje de resultados positivos en comparación con CRS (p < 0,05).(p < 0,05)(p < 0,05) Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов сравнению с CRS (p < 0,05). Además, el ensayo Sansure Biotech tuvo una tasa de positividad más baja en comparación con CRS (p < 0,05).El análisis de Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA y acuerdo general superó el 93,5 % con un valor de fuerza de acuerdo de Cohen Kappa de 0,925.Finalmente, el Sansure Biotech Assay (RUO) necesita una mayor validación para su uso en Etiopía, y se debe considerar una investigación adicional para evaluar las afirmaciones de los fabricantes individuales.
El diseño del estudio comparativo se llevó a cabo en cuatro centros de salud en Addis Abeba, el Hospital Eka Kotebe, el Centro de Tratamiento de la Iglesia Millennium, el Hospital Memorial Zewooditu y el Hospital Especializado en Tuberculosis de St. Peter.Los datos se recopilaron entre el 1 y el 31 de diciembre de 2020. Las instalaciones médicas para este estudio se eligieron a propósito en función de su gran cantidad de casos y la disponibilidad de los principales centros de tratamiento en la ciudad.De manera similar, los instrumentos, incluidos los instrumentos de PCR en tiempo real ABI 7500 y Abbott m2000, se seleccionaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes de reactivos NAAT, y se seleccionaron cuatro kits de detección de PCR para este estudio, ya que la mayoría de los laboratorios en Etiopía utilizaron al menos cuatro de ellos.Prueba genética, prueba Abbott SARS-CoV-2, prueba Sansure Biotech y prueba SARS-CoV-2 BGI realizadas durante el estudio).
La prueba de SARS-CoV-2 se realizó del 1 al 30 de diciembre de 2020 utilizando 3 ml de medio de transporte viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de personas bajo investigación por COVID-19 remitidas a EPHI.Las muestras nasofaríngeas fueron recolectadas por recolectores de muestras capacitados y enviadas a EPHI en paquetes triples.Antes del aislamiento del ácido nucleico, a cada muestra se le asigna un número de identificación único.La extracción se realiza de cada muestra inmediatamente después de su llegada utilizando métodos de extracción manuales y automáticos.Por lo tanto, para la extracción automática de Abbott m2000, se extrajeron 1,3 ml (incluidos 0,8 ml de volumen muerto y 0,5 ml de volumen de entrada de extracción) de la muestra de cada muestra y se pasaron por el Sistema de preparación de muestras de ADN de Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EE. UU.).) Se incluyó un lote de 96 [92 muestras, dos controles de detección y dos controles sin plantilla (NTC)] en el proceso general (recuperación y detección) de dos rondas de SARS-CoV-2 (EUA) en tiempo real.minería.Del mismo modo, para la extracción manual, utilice las mismas muestras (para la extracción y el descubrimiento automáticos).Por lo tanto, a lo largo del proceso, se dividieron en alícuotas de 140 µl de muestras y se extrajeron con el kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) en lotes de 24 (incluidas 20 muestras, dos controles de ensayo y dos NTC) durante nueve rondas.Los eluatos extraídos manualmente se amplificaron y detectaron con un termociclador ABI 7500 con el ensayo SARS-CoV-2 BGI, el ensayo Daan Gene y el ensayo Sansure Biotech.
El aislamiento y la purificación automatizados del ARN viral del SARS-CoV-2 siguen el principio de perlas magnéticas utilizando los reactivos de preparación de muestras de ADN de Abbott.La inactivación de las muestras y la solubilización de las partículas virales se lleva a cabo utilizando un detergente que contiene isotiocianato de guanidina para desnaturalizar la proteína e inactivar la RNasa.A continuación, el ARN se separa de la proteína mediante separación en fase sólida utilizando sílice, es decir, la sal de guanidinio y el pH alcalino del tampón de lisis favorecen la unión de los ácidos nucleicos a la sílice (SiO2).El paso de enjuague elimina las proteínas y los desechos restantes para producir una solución transparente.El ARN transparente se aísla de micropartículas a base de sílice utilizando el campo magnético del instrumento20,21.Por otro lado, el aislamiento y purificación manual del ARN se realiza mediante el método de columna giratoria utilizando centrifugación en lugar de soporte magnético y separación de micropartículas del eluyente.
La prueba de detección de SARS-CoV-2 en tiempo real de Abbott (Abbott Molecular, Inc.) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que recibió EUA19,22 de la OMS y la FDA.En este protocolo, la inactivación de la muestra antes de la extracción se realizó en un baño de agua a 56 °C durante 30 min.Después de la inactivación del virus, se realizó la extracción de ácido nucleico en un instrumento Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM utilizando un sistema de preparación de muestras de ADN Abbott m2000.según el fabricante.La amplificación y la detección se realizaron con un instrumento Abbott m2000 RT-PCR y se realizó una detección dual para los genes RdRp y N.ROX) y VIC P (colorante patentado) para la orientación y detección de controles internos, lo que permite la detección simultánea de ambos productos de amplificación 19 .
El método de detección de amplificación de este kit se basa en la tecnología RT-PCR de un solo paso.Los genes ORF1a/b y N fueron seleccionados como regiones conservadas por Daan Gene Technology para detectar la amplificación de la región diana.Se han diseñado cebadores específicos y sondas fluorescentes (sondas del gen N marcadas con FAM, sondas ORF1a/b marcadas con VIC) para detectar el ARN del SARS-CoV-2 en las muestras.El eluyente final y las mezclas maestras se prepararon agregando 5 µl de eluyente a 20 µl de la mezcla maestra hasta un volumen final de 25 µl.La amplificación y la detección se realizaron simultáneamente en un instrumento de PCR en tiempo real ABI 750024.
Los genes ORF1a/b y N se detectaron con el kit de diagnóstico de ácido nucleico nCoV-2019 de Sansure Biotech (detección por PCR fluorescente).Prepare sondas específicas para cada gen objetivo seleccionando el canal FAM para la región ORF1a/b y el canal ROX para el gen N.A este kit de ensayo, el eluyente y los reactivos de mezcla maestra se agregan de la siguiente manera: prepare 30 µl de reactivo de mezcla maestra y 20 µl de muestra eluida para detección/amplificación.Se utilizó PCR en tiempo real ABI 750025 para amplificación/detección.
La prueba SARS-CoV-2 BGI es un kit fluorescente de rRT-PCR en tiempo real para el diagnóstico de COVID-19.La región objetivo se encuentra en la región ORF1a/b del genoma del SARS-CoV-2, que es un método de detección de un solo gen.Además, el gen doméstico humano β-actina es un gen diana regulado internamente.La mezcla maestra se prepara mezclando 20 µl del reactivo de la mezcla maestra y 10 µl de la muestra de ARN extraída en una placa de pocillos26.Se usó un instrumento de PCR en tiempo real cuantitativo fluorescente ABI 7500 para la amplificación y detección.Toda la amplificación de ácidos nucleicos, las condiciones de ejecución de PCR para cada ensayo y la interpretación de los resultados se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante respectivo (Tabla 3).
En este análisis comparativo, no utilizamos el método estándar de referencia para determinar el porcentaje de acuerdo (positivo, negativo y general) y otros parámetros de comparación para los cuatro análisis.Cada comparación de prueba se realizó con CRS, en este estudio, el CRS se estableció mediante la regla "cualquier positivo" y el resultado se determinó, no por una sola prueba, usamos al menos dos resultados de prueba coincidentes.Además, en el caso de transmisión de COVID-19, los resultados falsos negativos son más peligrosos que los resultados falsos positivos.Por lo tanto, para decir "positivo" con la mayor precisión posible a partir de un resultado de CRS, al menos dos pruebas de ensayo deben ser positivas, lo que significa que es probable que al menos un resultado positivo provenga de un ensayo de EUA.Así, de cuatro resultados de la prueba, dos o más resultados de la prueba que dan el mismo resultado se consideran verdaderos positivos o negativos18,27.
Los datos se recopilaron mediante formularios de extracción de datos estructurados, la entrada y el análisis de datos se realizaron con el software estadístico Excel y SPSS versión 23.0 para estadísticas descriptivas.Se analizó la concordancia porcentual positiva, negativa y general, y se utilizó una puntuación Kappa para determinar el grado de concordancia de cada método con CRS.Los valores de Kappa se interpretan de la siguiente manera: 0,01 a 0,20 para concordancia leve, 0,21 a 0,40 para concordancia general, 0,41-0,60 para concordancia moderada, 0,61-0,80 para concordancia mayor y 0,81-0,99 para concordancia total28.
Se obtuvo autorización ética de la Universidad de Addis Abeba y todos los protocolos experimentales para este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión de Ética Científica del Instituto de Salud Pública de Etiopía.El número de referencia de la Licencia de ética de EPHI es EPHI/IRB-279-2020.Todos los métodos se aplicaron de acuerdo con las recomendaciones y disposiciones de las Directrices integrales nacionales etíopes para el tratamiento de COVID-19.Además, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes del estudio antes de participar en el estudio.
Todos los datos obtenidos o analizados en este estudio se incluyen en este artículo publicado.Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles del autor respectivo previa solicitud razonable.
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