Factores de interferencia en las reacciones de PCR

Durante la reacción de PCR, a menudo se encuentran algunos factores interferentes.
Debido a la altísima sensibilidad de la PCR, la contaminación se considera uno de los factores más importantes que afectan a los resultados de la PCR y puede producir resultados falsos positivos.
Igualmente críticas son las diversas fuentes que conducen a resultados falsos negativos. Si uno o más componentes esenciales de la mezcla de PCR o la propia reacción de amplificación se inhiben o interfieren, el ensayo de diagnóstico puede verse afectado. Esto puede reducir la eficiencia e incluso generar resultados falsos negativos.
Además de la inhibición, la integridad del ácido nucleico diana puede perderse debido a las condiciones de envío o almacenamiento previas a la preparación de la muestra. En particular, las altas temperaturas o un almacenamiento inadecuado pueden dañar las células y los ácidos nucleicos. La fijación de células y tejidos, así como la inclusión en parafina, son causas bien conocidas de fragmentación del ADN y un problema persistente (véanse las figuras 1 y 2). En estos casos, ni siquiera un aislamiento y una purificación óptimos serán eficaces.

Figura 1 | Efecto de la inmovilización en la integridad del ADN
La electroforesis en gel de agarosa mostró una variación considerable en la calidad del ADN aislado de cortes de parafina de autopsias. Se observó ADN con diferentes longitudes promedio de fragmentos en los extractos, según el método de fijación. El ADN solo se conservó al fijarse en muestras nativas congeladas y en formalina neutra tamponada. El uso de un fijador Bouin fuertemente ácido o de formalina con ácido fórmico sin tampón provocó una pérdida significativa de ADN. La fracción restante está altamente fragmentada.
A la izquierda, la longitud de los fragmentos se expresa en kilopares de bases (kbp).

Figura 2 | Pérdida de integridad de los objetivos de ácidos nucleicos
(a) Una brecha 3′-5′ en ambas cadenas resultará en una ruptura del ADN diana. La síntesis de ADN se seguirá produciendo en el fragmento pequeño. Sin embargo, si falta un sitio de hibridación del cebador en el fragmento de ADN, solo se produce una amplificación lineal. En el caso más favorable, los fragmentos pueden resaturarse entre sí, pero los rendimientos serán bajos e inferiores a los niveles de detección.
(b) La pérdida de bases, principalmente debida a la despurinización y la formación de dímeros de timidina, provoca una disminución del número de enlaces de hidrógeno y de la temperatura de fusión (Tm). Durante la fase de calentamiento prolongado, los cebadores se desprenderán del ADN de la matriz y no se anillarán, incluso en condiciones menos rigurosas.
(c) Las bases de timina adyacentes forman un dímero TT.
Otro problema común en el diagnóstico molecular es la liberación deficiente de los ácidos nucleicos diana en comparación con la extracción con fenol-cloroformo. En casos extremos, esto puede generar falsos negativos. La lisis por ebullición o la digestión enzimática de los restos celulares pueden ahorrar mucho tiempo, pero este método suele resultar en una baja sensibilidad de la PCR debido a una liberación insuficiente de ácidos nucleicos.

Inhibición de la actividad de la polimerasa durante la amplificación

En general, la inhibición se utiliza como un concepto contenedor para describir todos los factores que conducen a resultados subóptimos de PCR. En un sentido estrictamente bioquímico, la inhibición se limita a la actividad de la enzima; es decir, reduce o impide la conversión de sustrato a producto mediante la interacción con el sitio activo de la ADN polimerasa o su cofactor (p. ej., Mg₂₄ para la ADN polimerasa Taq).
Los componentes de la muestra o varios tampones y extractos que contienen reactivos pueden inhibir directamente la enzima o atrapar sus cofactores (por ejemplo, EDTA), inactivando así la polimerasa y, a su vez, dando lugar a resultados de PCR disminuidos o falsos negativos.
Sin embargo, muchas interacciones entre los componentes de la reacción y los ácidos nucleicos que contienen la diana también se denominan «inhibidores de la PCR». Una vez que la integridad de la célula se ve alterada por el aislamiento y se libera el ácido nucleico, pueden producirse interacciones entre la muestra y la solución y la fase sólida circundantes. Por ejemplo, los «depuradores» pueden unirse al ADN monocatenario o bicatenario mediante interacciones no covalentes e interferir con el aislamiento y la purificación al reducir el número de dianas que finalmente llegan al recipiente de reacción de PCR.
En general, los inhibidores de PCR están presentes en la mayoría de los fluidos corporales y reactivos utilizados para pruebas de diagnóstico clínico (urea en orina, hemoglobina y heparina en sangre), suplementos dietéticos (componentes orgánicos, glucógeno, grasa, iones Ca2+) y componentes del medio ambiente (fenoles, metales pesados).

Los inhibidores de PCR más comunes se encuentran en bacterias y células eucariotas, ADN no diana, macromoléculas de matriz tisular que se unen al ADN y equipos de laboratorio como guantes y plásticos. La purificación de ácidos nucleicos durante o después de la extracción es el método preferido para eliminar los inhibidores de PCR.
Hoy en día, diversos equipos de extracción automatizados pueden reemplazar muchos protocolos manuales, pero nunca se ha logrado una recuperación o purificación completa de las dianas. Es posible que aún haya inhibidores potenciales en los ácidos nucleicos purificados o que ya hayan surtido efecto. Existen diferentes estrategias para reducir el impacto de los inhibidores. La elección de la polimerasa adecuada puede tener un impacto significativo en la actividad del inhibidor. Otros métodos probados para reducir la inhibición de la PCR son aumentar la concentración de polimerasa o aplicar aditivos como la BSA.
La inhibición de las reacciones de PCR se puede demostrar mediante el uso del control de calidad del proceso interno (IPC).
Se debe tener cuidado de eliminar todos los reactivos y demás soluciones del kit de extracción, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol y fenol, del aislado de ácido nucleico mediante un lavado exhaustivo. Dependiendo de su concentración, pueden activar o inhibir la PCR.