Factores de interferencia en las reacciones de PCR

Durante la reacción de PCR, a menudo se encuentran algunos factores interferentes.
Debido a la muy alta sensibilidad de la PCR, la contaminación se considera uno de los factores más importantes que afectan los resultados de la PCR y puede producir resultados falsos positivos.
Igualmente críticos son las diversas fuentes que conducen a resultados falsos negativos. Si una o más partes esenciales de la mezcla de PCR o la reacción de amplificación en sí misma se inhiben o interfieren, el ensayo de diagnóstico puede obstaculizarse. Esto puede conducir a una eficiencia reducida e incluso a resultados falsos negativos.
Además de la inhibición, la pérdida de integridad del ácido nucleico objetivo puede ocurrir debido a las condiciones de envío y/o almacenamiento antes de la preparación de la muestra. En particular, las altas temperaturas o el almacenamiento inadecuado pueden provocar daños de células y ácidos nucleicos. La fijación celular y tisular y la incrustación de parafina son causas bien conocidas de fragmentación de ADN y un problema persistente (ver Figuras 1 y 2). En estos casos, incluso el aislamiento y la purificación óptimos no ayudarán.

Figura 1 | Efecto de la inmovilización en la integridad del ADN
La electroforesis en gel de agarosa mostró que la calidad del ADN aislada de las secciones de parafina de las autopsias variaba considerablemente. El ADN de diferentes longitudes de fragmento promedio estaba presente en los extractos dependiendo del método de fijación. El ADN se conservó solo cuando se fijó en muestras congeladas nativas y en formalina neutra tamponada. El uso de una formalina fijadora de bouína fuertemente ácida o sin topar con el ácido fórmico resultó en una pérdida significativa de ADN. La fracción restante está altamente fragmentada.
A la izquierda, la longitud de los fragmentos se expresa en pares de kilobase (KBP)

Figura 2 | Pérdida de integridad de objetivos de ácido nucleico
(A) Una brecha 3'-5 'en ambos hilos dará como resultado una ruptura en el ADN objetivo. La síntesis de ADN aún se producirá en el pequeño fragmento. Sin embargo, si falta un sitio de recocido de cebador en el fragmento de ADN, solo se produce amplificación lineal. En el caso más favorable, los fragmentos pueden reaturarse entre sí, pero los rendimientos serán pequeños y por debajo de los niveles de detección.
(b) La pérdida de bases, principalmente debido a la depuración y la formación de dímero de timidina, conduce a una disminución en el número de enlaces H y una disminución en TM. Durante la fase de calentamiento alargada, los cebadores se derretirán del ADN de la matriz y no se recubrirán incluso en condiciones menos estrictas.
(c) Las bases de timina adyacentes forman un dímero TT.
Otro problema común que a menudo ocurre en el diagnóstico molecular es la liberación menos que óptima de los ácidos nucleicos diana en comparación con la extracción de fenol-cloroformo. En casos extremos, esto puede asociarse con falsos negativos. Se puede ahorrar mucho tiempo mediante lisis hirviendo o digestión enzimática de los restos celulares, pero este método a menudo da como resultado una baja sensibilidad de PCR debido a la liberación insuficiente del ácido nucleico.

Inhibición de la actividad de la polimerasa durante la amplificación

En general, la inhibición se usa como un concepto de contenedor para describir todos los factores que conducen a resultados de PCR subóptimos. En un sentido estrictamente bioquímico, la inhibición se limita a la actividad de la enzima, es decir, reduce o previene la conversión del producto de sustrato a través de la interacción con el sitio activo de la ADN polimerasa o su cofactor (EG, Mg2+ para la ADN polimerasa Taq).
Los componentes en la muestra o varios tampones y extractos que contienen reactivos pueden inhibir directamente la enzima o atrapar sus cofactores (p. Ej.
Sin embargo, muchas interacciones entre los componentes de reacción y los ácidos nucleicos que contienen objetivo también se designan como "inhibidores de la PCR". Una vez que la integridad de la célula se ve interrumpida por el aislamiento y se libera el ácido nucleico, pueden ocurrir interacciones entre la muestra y su solución circundante y fase sólida. Por ejemplo, los 'carroñeros' pueden unir el ADN de cadena simple o doble a través de interacciones no covalentes e interferir con el aislamiento y la purificación al reducir el número de objetivos que eventualmente alcanzan el vaso de reacción de PCR.
En general, los inhibidores de la PCR están presentes en la mayoría de los fluidos y reactivos corporales utilizados para pruebas de diagnóstico clínico (urea en orina, hemoglobina y heparina en la sangre), suplementos dietéticos (componentes orgánicos, glucógeno, grasas, iones Ca2+) y componentes en el medio ambiente (fenols, metales pesados)

Se pueden encontrar inhibidores de PCR más prevalentes en bacterias y células eucariotas, ADN no objetivo, macromoléculas de matrices de tejidos y equipos de laboratorio que se unen al ADN como guantes y plásticos. La purificación de los ácidos nucleicos durante o después de la extracción es el método preferido para eliminar los inhibidores de la PCR.
Hoy, varios equipos de extracción automatizados pueden reemplazar muchos protocolos manuales, pero nunca se ha logrado la recuperación del 100% y/o la purificación de los objetivos. Los inhibidores potenciales aún pueden estar presentes en los ácidos nucleicos purificados o pueden haber tenido efecto. Existen diferentes estrategias para reducir el impacto de los inhibidores. La elección de la polimerasa apropiada puede tener un impacto significativo en la actividad del inhibidor. Otros métodos comprobados para reducir la inhibición de la PCR son aumentar la concentración de polimerasa o aplicar aditivos como BSA.
La inhibición de las reacciones de PCR se puede demostrar mediante el uso del control de calidad del proceso interno (IPC).
Se debe tener cuidado para eliminar todos los reactivos y otras soluciones en el kit de extracción, como etanol, EDTA, CETAB, LiCL, GUSCN, SDS, isopropanol y fenol, del aislado del ácido nucleico mediante un paso de lavado exhaustivo. Dependiendo de su concentración, pueden activar o inhibir la PCR.