Factores de interferencia en reacciones de PCR.

Durante la reacción de PCR, a menudo se encuentran algunos factores que interfieren.
Debido a la muy alta sensibilidad de la PCR, la contaminación se considera uno de los factores más importantes que afectan los resultados de la PCR y puede producir resultados falsos positivos.
Igualmente críticas son las diversas fuentes que conducen a resultados falsos negativos. Si una o más partes esenciales de la mezcla de PCR o la propia reacción de amplificación se inhiben o interfieren, el ensayo de diagnóstico puede verse obstaculizado. Esto puede provocar una reducción de la eficiencia e incluso resultados falsos negativos.
Además de la inhibición, puede producirse una pérdida de la integridad del ácido nucleico objetivo debido a las condiciones de envío y/o almacenamiento antes de la preparación de la muestra. En particular, las altas temperaturas o un almacenamiento inadecuado pueden provocar daños en las células y los ácidos nucleicos. La fijación de células y tejidos y la inclusión en parafina son causas bien conocidas de fragmentación del ADN y un problema persistente (ver Figuras 1 y 2). En estos casos, ni siquiera un aislamiento y una purificación óptimos ayudarán.

Figura 1 | Efecto de la inmovilización sobre la integridad del ADN.
La electroforesis en gel de agarosa mostró que la calidad del ADN aislado de secciones de parafina de autopsias variaba considerablemente. En los extractos estaba presente ADN de diferentes longitudes promedio de fragmentos según el método de fijación. El ADN se conservó sólo cuando se fijó en muestras nativas congeladas y en formalina neutra tamponada. El uso de un fijador Bouin fuertemente ácido o formalina que contiene ácido fórmico sin tampón resultó en una pérdida significativa de ADN. La fracción restante está muy fragmentada.
A la izquierda, la longitud de los fragmentos se expresa en kilopares de bases (kbp).

Figura 2 | Pérdida de integridad de las dianas de ácidos nucleicos.
(a) Un espacio de 3′-5′ en ambas cadenas dará como resultado una rotura en el ADN objetivo. La síntesis de ADN seguirá ocurriendo en el pequeño fragmento. Sin embargo, si falta un sitio de hibridación del cebador en el fragmento de ADN, sólo se produce una amplificación lineal. En el caso más favorable, los fragmentos pueden resaturarse entre sí, pero los rendimientos serán pequeños y estarán por debajo de los niveles de detección.
(b) La pérdida de bases, principalmente debido a la depurinación y la formación de dímeros de timidina, conduce a una disminución en el número de enlaces H y una disminución en la Tm. Durante la fase de calentamiento alargada, los cebadores se desprenderán de la matriz de ADN y no se fusionarán ni siquiera en condiciones menos estrictas.
(c) Las bases de timina adyacentes forman un dímero TT.
Otro problema común que ocurre a menudo en el diagnóstico molecular es la liberación inferior a la óptima de los ácidos nucleicos diana en comparación con la extracción con fenol-cloroformo. En casos extremos, esto puede estar asociado con falsos negativos. Se puede ahorrar mucho tiempo mediante la lisis por ebullición o la digestión enzimática de restos celulares, pero este método a menudo da como resultado una baja sensibilidad de la PCR debido a una liberación insuficiente de ácido nucleico.

Inhibición de la actividad polimerasa durante la amplificación.

En general, la inhibición se utiliza como concepto contenedor para describir todos los factores que conducen a resultados de PCR subóptimos. En un sentido estrictamente bioquímico, la inhibición se limita a la actividad de la enzima, es decir, reduce o previene la conversión de sustrato-producto mediante la interacción con el sitio activo de la ADN polimerasa o su cofactor (p. ej., Mg2+ para la ADN polimerasa Taq).
Los componentes de la muestra o varios tampones y extractos que contienen reactivos pueden inhibir directamente la enzima o atrapar sus cofactores (por ejemplo, EDTA), inactivando así la polimerasa y, a su vez, provocando resultados de PCR disminuidos o falsos negativos.
Sin embargo, muchas interacciones entre los componentes de la reacción y los ácidos nucleicos que contienen el objetivo también se denominan "inhibidores de la PCR". Una vez que el aislamiento altera la integridad de la célula y se libera el ácido nucleico, pueden ocurrir interacciones entre la muestra y la solución circundante y la fase sólida. Por ejemplo, los 'eliminadores' pueden unirse al ADN monocatenario o bicatenario mediante interacciones no covalentes e interferir con el aislamiento y la purificación al reducir el número de objetivos que finalmente llegan al recipiente de reacción de la PCR.
En general, los inhibidores de la PCR están presentes en la mayoría de los fluidos corporales y reactivos utilizados para las pruebas de diagnóstico clínico (urea en orina, hemoglobina y heparina en sangre), suplementos dietéticos (componentes orgánicos, glucógeno, grasas, iones Ca2+) y componentes del medio ambiente (fenoles). , metales pesados)

Los inhibidores de la PCR más frecuentes se pueden encontrar en bacterias y células eucariotas, ADN no objetivo, macromoléculas de unión al ADN de matrices tisulares y equipos de laboratorio como guantes y plásticos. La purificación de ácidos nucleicos durante o después de la extracción es el método preferido para eliminar los inhibidores de la PCR.
Hoy en día, varios equipos de extracción automatizados pueden reemplazar muchos protocolos manuales, pero nunca se ha logrado el 100% de recuperación y/o purificación de los objetivos. Es posible que todavía haya inhibidores potenciales presentes en los ácidos nucleicos purificados o que ya hayan surtido efecto. Existen diferentes estrategias para reducir el impacto de los inhibidores. La elección de la polimerasa adecuada puede tener un impacto significativo en la actividad inhibidora. Otros métodos probados para reducir la inhibición de la PCR son aumentar la concentración de polimerasa o aplicar aditivos como BSA.
La inhibición de las reacciones de PCR se puede demostrar mediante el uso de control de calidad del proceso interno (IPC).
Se debe tener cuidado de eliminar todos los reactivos y otras soluciones del kit de extracción, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol y fenol, del aislado de ácido nucleico mediante un paso de lavado minucioso. Dependiendo de su concentración, pueden activar o inhibir la PCR.