Factores de interferencia en las reacciones de PCR

Durante la reacción de PCR, a menudo se encuentran algunos factores que interfieren.
Debido a la muy alta sensibilidad de la PCR, la contaminación se considera uno de los factores más importantes que afectan los resultados de la PCR y puede producir resultados falsos positivos.
Igualmente críticas son las diversas fuentes que conducen a resultados falsos negativos.Si una o más partes esenciales de la mezcla de PCR o la propia reacción de amplificación se inhiben o interfieren, el ensayo de diagnóstico puede verse obstaculizado.Esto puede conducir a una eficiencia reducida e incluso a resultados falsos negativos.
Además de la inhibición, puede producirse una pérdida de la integridad del ácido nucleico diana debido a las condiciones de envío y/o almacenamiento antes de la preparación de la muestra.En particular, las altas temperaturas o el almacenamiento inadecuado pueden provocar daños en las células y los ácidos nucleicos.La fijación de células y tejidos y la inclusión en parafina son causas bien conocidas de fragmentación del ADN y un problema persistente (véanse las Figuras 1 y 2).En estos casos, incluso el aislamiento y la purificación óptimos no ayudarán.

Figura 1 |Efecto de la inmovilización en la integridad del ADN
La electroforesis en gel de agarosa mostró que la calidad del ADN aislado de las secciones de parafina de las autopsias varió considerablemente.El ADN de diferentes longitudes promedio de fragmentos estaba presente en los extractos según el método de fijación.El ADN se conservó solo cuando se fijó en muestras nativas congeladas y en formalina neutra tamponada.El uso de un fijador de Bouin fuertemente ácido o formalina que contiene ácido fórmico no tamponado resultó en una pérdida significativa de ADN.La fracción restante está muy fragmentada.
A la izquierda, la longitud de los fragmentos se expresa en kilopares de bases (kbp)

Figura 2 |Pérdida de integridad de los objetivos de ácido nucleico
(a) Una brecha de 3′-5′ en ambas cadenas dará como resultado una ruptura en el ADN objetivo.la síntesis de ADN seguirá ocurriendo en el fragmento pequeño.Sin embargo, si falta un sitio de hibridación del cebador en el fragmento de ADN, solo se produce una amplificación lineal.En el caso más favorable, los fragmentos pueden resaturarse entre sí, pero los rendimientos serán pequeños y por debajo de los niveles de detección.
(b) La pérdida de bases, principalmente debido a la depuración y la formación de dímero de timidina, conduce a una disminución en el número de enlaces H y una disminución en la Tm.Durante la fase de calentamiento alargada, los cebadores se derretirán del ADN de la matriz y no se aparearán incluso en condiciones menos estrictas.
(c) Las bases de timina adyacentes forman un dímero TT.
Otro problema común que ocurre a menudo en el diagnóstico molecular es la liberación menos que óptima de los ácidos nucleicos objetivo en comparación con la extracción con fenol-cloroformo.En casos extremos, esto puede estar asociado con falsos negativos.Se puede ahorrar mucho tiempo mediante la lisis por ebullición o la digestión enzimática de los restos celulares, pero este método a menudo da como resultado una baja sensibilidad de la PCR debido a una liberación insuficiente de ácido nucleico.

Inhibición de la actividad de la polimerasa durante la amplificación

En general, la inhibición se utiliza como un concepto contenedor para describir todos los factores que conducen a resultados de PCR subóptimos.En un sentido estrictamente bioquímico, la inhibición se limita a la actividad de la enzima, es decir, reduce o previene la conversión sustrato-producto a través de la interacción con el sitio activo de la ADN polimerasa o su cofactor (p. ej., Mg2+ para Taq ADN polimerasa).
Los componentes de la muestra o varios tampones y extractos que contienen reactivos pueden inhibir directamente la enzima o atrapar sus cofactores (p. ej., EDTA), inactivando así la polimerasa y, a su vez, dando lugar a resultados de PCR disminuidos o falsos negativos.
Sin embargo, muchas interacciones entre los componentes de la reacción y los ácidos nucleicos que contienen la diana también se denominan "inhibidores de la PCR".Una vez que la integridad de la célula se interrumpe por el aislamiento y se libera el ácido nucleico, pueden ocurrir interacciones entre la muestra y su solución circundante y la fase sólida.Por ejemplo, los "depuradores" pueden unirse al ADN de una o dos cadenas a través de interacciones no covalentes e interferir con el aislamiento y la purificación al reducir la cantidad de objetivos que finalmente llegan al recipiente de reacción de la PCR.
En general, los inhibidores de la PCR están presentes en la mayoría de los fluidos corporales y reactivos utilizados para las pruebas de diagnóstico clínico (urea en orina, hemoglobina y heparina en sangre), suplementos dietéticos (componentes orgánicos, glucógeno, grasa, iones Ca2+) y componentes en el medio ambiente (fenoles , metales pesados)

Los inhibidores de PCR más frecuentes se pueden encontrar en bacterias y células eucariotas, ADN no diana, macromoléculas de unión al ADN de matrices tisulares y equipos de laboratorio como guantes y plásticos.La purificación de ácidos nucleicos durante o después de la extracción es el método preferido para eliminar los inhibidores de PCR.
Hoy en día, varios equipos de extracción automatizados pueden reemplazar muchos protocolos manuales, pero nunca se ha logrado una recuperación o purificación del 100 % de los objetivos.Los inhibidores potenciales aún pueden estar presentes en los ácidos nucleicos purificados o pueden haber hecho efecto ya.Existen diferentes estrategias para reducir el impacto de los inhibidores.La elección de la polimerasa apropiada puede tener un impacto significativo en la actividad del inhibidor.Otros métodos probados para reducir la inhibición de la PCR son aumentar la concentración de polimerasa o aplicar aditivos como BSA.
La inhibición de las reacciones de PCR se puede demostrar mediante el uso del control de calidad del proceso interno (IPC).
Se debe tener cuidado de eliminar todos los reactivos y otras soluciones del kit de extracción, como etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol y fenol, del aislado de ácido nucleico mediante un paso de lavado completo.Dependiendo de su concentración, pueden activar o inhibir la PCR.