Realización de cuatro ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para identificar el SARS-CoV-2 en Etiopía

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Desde el brote de la enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19), se han desarrollado numerosas pruebas comerciales de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) en todo el mundo, convirtiéndose en ensayos estándar. Si bien varias pruebas se desarrollaron rápidamente y se aplicaron a pruebas de diagnóstico de laboratorio, su rendimiento no se ha evaluado en diversos entornos. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento de los ensayos Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI y Sansure Biotech utilizando el Estándar de Referencia Compuesto (CRS). El estudio se llevó a cabo en el Instituto de Salud Pública de Etiopía (EPHI) del 1 al 30 de diciembre de 2020. Se extrajeron 164 muestras nasofaríngeas utilizando el minikit QIAamp RNA y el sistema de preparación de muestras de ADN de Abbott. De las 164 muestras, el 59,1 % fueron positivas y el 40,9 % negativas para CRS. La positividad de Sansure Biotech fue significativamente baja en comparación con CRS (p < 0,05). La positividad de Sansure Biotech fue significativamente baja en comparación con CRS (p < 0,05). Los resultados de Sansure Biotech no están disponibles en CRS (p < 0,05). Los resultados positivos de Sansure Biotech fueron significativamente menores en comparación con CRS (p < 0,05).Según CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05).Según CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05). Sansure Biotech tiene muchos resultados positivos para CRS (p < 0,05). Sansure Biotech tuvo significativamente menos resultados positivos en comparación con CRS (p < 0,05).La concordancia general de los cuatro análisis fue del 96,3-100 % en comparación con el CRS. Además de la baja tasa de positividad del ensayo de Sansure Biotech, el rendimiento de los cuatro ensayos fue prácticamente comparable. Por lo tanto, el ensayo de Sansure Biotech [Solo para Investigación (RUO)] requiere validación adicional para su uso en Etiopía. Finalmente, se debe considerar la realización de investigaciones adicionales para evaluar los ensayos con las especificaciones del fabricante correspondientes.
Las pruebas de laboratorio forman parte del Plan Estratégico de Preparación y Respuesta (PEPR) de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la Enfermedad por Coronavirus 2019 (COVID-19). La OMS recomienda a los países fortalecer la capacidad de laboratorio para mejorar la preparación, la gestión adecuada de los casos, la vigilancia y la respuesta rápida a los desafíos de salud pública. Esto sugiere que el papel del laboratorio es fundamental para caracterizar la enfermedad y la epidemiología de los agentes infecciosos emergentes, así como para controlar su propagación.
El diagnóstico de la COVID-19 requiere información epidemiológica y médica, síntomas/signos personales y datos radiográficos y de laboratorio2. Desde que se informó del brote de la COVID-19 en Wuhan, China, se han desarrollado muchas pruebas comerciales de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) en todo el mundo. La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) se ha utilizado como método rutinario y estándar para el diagnóstico de laboratorio de la infección por el síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2)3. La detección molecular del SARS-CoV-2 se basa típicamente en los genes N (gen de la proteína de la nucleocápside), E (gen de la proteína de la envoltura) y RdRp (gen de la ARN polimerasa dependiente de ARN) en la región ORF1a/b (marco de lectura abierto 1a/b). gen) identificada a partir del genoma viral. Se consideran las principales regiones conservadas que se encuentran en los genomas virales para el reconocimiento del virus4. Entre estos genes, los genes RdRp y E tienen una alta sensibilidad de detección analítica, mientras que el gen N tiene una baja sensibilidad analítica5.
El rendimiento de los ensayos de PCR puede variar dependiendo de varios factores tales como: reactivos de extracción, reactivos de amplificación/detección, método de extracción, calidad de la máquina de PCR y otros instrumentos. A partir de abril de 2020, más de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nueve países han recibido Autorización de Uso de Emergencia (EUA) para diagnósticos de COVID-196. En Etiopía, más de 14 plataformas de PCR en tiempo real se utilizan para la detección por PCR de SARS-CoV-2 en 26 instituciones de salud pública, incluyendo ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 y Quant-studio7. Además, varios kits de prueba de PCR están disponibles, tales como prueba Daan Gene, prueba Abbott SARS-CoV-2, prueba Sansure Biotech y prueba SARS-CoV-2 BGI. Aunque rRT-PCR es altamente sensible, algunos pacientes con COVID-19 reportan resultados negativos falsos debido a copias insuficientes de ácido ribonucleico viral (ARN) en muestras debido a recolección, transporte, almacenamiento y manejo inadecuados, y pruebas de laboratorio. condiciones y acciones del personal8. Además, el manejo incorrecto de la muestra o el control, la configuración del umbral de ciclo (Ct) y la reactividad cruzada con otros ácidos nucleicos patógenos o ARN inactivo/residual del SARS-CoV-2 pueden dar lugar a resultados falsos positivos en los ensayos de rRT-PCR9. Por lo tanto, está claro que las pruebas de PCR pueden identificar portadores de fragmentos de genes, ya que ni siquiera pueden distinguir entre genes virales verdaderamente activos, por lo que las pruebas solo pueden identificar portadores y no pacientes10. Por lo tanto, es importante evaluar el rendimiento diagnóstico utilizando métodos estándar en nuestro entorno. Aunque muchos reactivos NAAT están disponibles en el Instituto de Salud Pública de Etiopía (EPHI) y en todo el país, aún no se ha informado de una evaluación comparativa de su eficacia. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento comparativo de los kits disponibles comercialmente para la detección del SARS-CoV-2 por rRT-PCR utilizando muestras clínicas.
Se incluyó en este estudio a un total de 164 participantes con sospecha de COVID-19. La mayoría de las muestras provinieron de centros de tratamiento (118/164 = 72%), mientras que los 46 participantes restantes (28%) provenían de centros sin tratamiento. Entre los participantes no tratados en el centro, 15 (9,1%) presentaron casos clínicamente sospechosos y 31 (18,9%) tuvieron contacto con casos confirmados. Noventa y tres (56,7%) participantes eran varones, y la edad media (± DE) de los participantes fue de 31,10 (± 11,82) años.
En este estudio, se determinaron las tasas de positividad y negatividad de cuatro pruebas para COVID-19. Por lo tanto, las tasas de positividad de los ensayos Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI y Sansure Biotech 2019-nCoV fueron del 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % y 55,5 %, respectivamente. Las puntuaciones positivas y negativas del estándar de referencia compuesto (CRS) fueron de 97 (59,1 %) y 67 (40,9 %), respectivamente (Tabla 1). En este estudio, la definición de CRS se basó en la regla de "cualquier positivo", según la cual, de cuatro resultados de prueba, dos o más resultados de prueba que arrojaron el mismo resultado se consideraron verdaderos positivos o negativos.
En este estudio, se encontró una concordancia porcentual negativa (APN) del 100 % (IC del 95 %: 94,6-100) para todos los análisis, en comparación con el CRS. El análisis de Sansure Biotechnology mostró una APN mínima del 93,8 % (IC del 95 %: 87,2-97,1), y el análisis de Daan Gene 2019-nCoV presentó una concordancia general del 99,4 % (IC del 95 %: 96,6-99,9). Por el contrario, la concordancia general entre el ensayo SARS-CoV-2 BGI y el ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV fue del 98,8 % y el 96,3 %, respectivamente (Tabla 2).
El coeficiente de concordancia kappa de Cohen entre los resultados del ensayo CRS y los del ensayo Abbott SARS-CoV-2 fue completamente consistente (K = 1,00). De igual manera, los valores kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI y Sansure Biotech 2019-nCoV también son completamente consistentes con el CRS (K ≥ 0,925). En este análisis comparativo, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró que los resultados del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV fueron significativamente diferentes de los resultados del CRS (p = 0,031) (Tabla 2).
Como se muestra en la Fig.1 el porcentaje del valor Ct más bajo (< 20 Ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp y N combinados) fue del 87,6 % y el valor Ct del gen ORF1a/b del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de valor Ct bajo (< 20 Ct) fue del 50,3 % y el valor Ct alto (36–40 Ct) fue del 3,2 %. 1 el porcentaje del valor Ct más bajo (< 20 Ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp y N combinados) fue del 87,6 % y el valor Ct del gen ORF1a/b del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de valor Ct bajo (< 20 Ct) fue del 50,3 % y el valor Ct alto (36–40 Ct) fue del 3,2 %.Como se muestra en la Fig.1, el nombre actual de Ct (< 20 Ct) es del 87,6%, y el Ct gen ORF1a/b es de 87,6%. Análisis de Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, el porcentaje del análisis del valor Ct más bajo (<20 Ct) de Abbott SARS-CoV-2 (gen combinado RdRp y N) fue del 87,6%, y el valor Ct del análisis del gen ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de valor Ct bajo (<20 Ct) representó el 50,3%, y el valor Ct alto (36–40 Ct) representó el 3,2%.1 año, Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36–40 Ct)的百分比为3.2%。 Como se muestra en la Figura 1, el porcentaje de valor Ct más bajo (< 20 Ct) de la prueba Abbott SARS-CoV-2 (combinación de genes RdRp y N) es del 87,6%, el valor Ct del gen ORF1a/b de la prueba Sansure Biotech 2019-nCoV muestra un porcentaje Ct bajo (< 20 Ct) del 50,3% y el porcentaje Ct bajo (36–40 Ct) del 3,2%. Como parte del riesgo 1, el análisis de Abbott SARS-CoV-2 (géneros RdRp y N) es el mismo que el actual Ct (< 20 Ct) en el área 87,6%, según Ct Generación ORF1a/b en el sector sanitario Sansure Biotech 2019- Análisis nCoV показал низкий Ct. Como se muestra en la Figura 1, el ensayo Abbott SARS-CoV-2 (que combina los genes RdRp y N) tuvo el valor de Ct porcentual más bajo (<20 Ct) con 87,6%, mientras que el valor de Ct del gen ORF1a/b en el estudio Sansure Biotech 2019 – El análisis de nCoV mostró un Ct bajo. El tamaño más grande (< 20 Ct) equivale al 50,3%, el más alto (36–40 Ct) aproximadamente al 3,2%. El porcentaje de valores (< 20 Ct) fue del 50,3% y el porcentaje de valores Ct altos (36–40 Ct) fue del 3,2%.La prueba Abbott SARS-CoV-2 B registró valores Ct superiores a 30. Por otra parte, en el ensayo BGI SARS-CoV-2 el gen ORF1a/b presentó un valor Ct alto (>36 Ct) el porcentaje fue del 4% (Fig. 1). Por otra parte, en el ensayo BGI SARS-CoV-2 el gen ORF1a/b presentó un valor Ct alto (>36 Ct) el porcentaje fue del 4% (Fig. 1). С другой стороны, en el análisis de BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составлял 4% (risa. 1). Por otra parte, en el análisis de BGI el gen ORF1a/b del SARS-CoV-2 presentó un valor Ct alto (>36 Ct), cuyo porcentaje fue del 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Por otro lado, en la detección de SARS-CoV-2 mediante BGI, el porcentaje del gen ORF1a/b con valor Ct alto (>36 Ct) es del 4% (Figura 1). С другой стороны, анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) sostavil 4% (risa. 1). Por otro lado, en el análisis BGI SARS-CoV-2, el porcentaje de genes ORF1a/b con valores de Ct altos (>36 Ct) fue del 4% (Fig. 1).
En este estudio, se tomaron 164 muestras nasofaríngeas. Para todos los tipos de ensayos, el aislamiento y la amplificación del ARN se realizaron utilizando los métodos y kits recomendados por los respectivos fabricantes.
Este estudio demostró que la prueba de Abbott para SARS-CoV-2 tiene el mismo rendimiento de detección que CRS, con 100% de concordancia positiva, negativa y general. El acuerdo kappa de Cohen es 1,00, lo que indica un acuerdo completo con CRS. Un estudio similar realizado por la Universidad de Washington en los EE. UU. encontró que la sensibilidad y especificidad generales de la prueba de Abbott para SARS-CoV-2 fue del 93% y 100%, respectivamente, en comparación con el ensayo determinado por laboratorio (LDA) de los CDC. 11. El sistema de detección de SARS-CoV-2 de Abbott se basa en la detección combinada simultánea de los genes N y RdRp, ya que ambos genes son más sensibles, lo que minimiza los falsos negativos12. Un estudio en Viena, Austria, también mostró que los grandes volúmenes de muestra de extracción y los volúmenes de eluyente de detección minimizaron los efectos de dilución y aumentaron la eficiencia de detección13. De este modo, la combinación perfecta de Abbott para el ensayo del SARS-CoV-2 se puede asociar con un sistema de detección de plataforma que detecta simultáneamente genes combinatorios, extrae una gran cantidad de muestras (0,5 ml) y utiliza una gran cantidad de eluyente (40 µl).
Nuestros resultados también mostraron que el rendimiento de detección de la prueba genética Daan fue prácticamente igual al de la CRS. Esto concuerda con un estudio14 realizado en la Universidad de Anhui en Huainan, China, y con la afirmación del fabricante de una concordancia positiva del 100 %. A pesar de los informes de resultados consistentes, una muestra dio un falso negativo tras volver a analizar el mismo eluido, pero dio positivo en los ensayos Abbott SARS-CoV-2 y Sansure Biotech nCoV-2019. Esto sugiere que podría haber variabilidad en los resultados entre los diferentes tipos de ensayos. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo del gen Daan fue significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con el ensayo de referencia definido en laboratorio. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo del gen Daan fue significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con el ensayo de referencia definido en laboratorio. No lo mencioné, en el estudio, proporcionado por Kita15, el análisis de los resultados de Daan Gene fue exclusivo (p < 0,05) de este laboratorio de metal análisis. Sin embargo, en un estudio realizado en China15, el resultado del análisis de Daan Gene fue significativamente diferente (p < 0,05) de su análisis de referencia de laboratorio.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p <0,05）。然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с ego Prueba de laboratorio estadounidense. Sin embargo, en un estudio realizado en China15, los resultados de la prueba genética de Daan fueron significativamente diferentes (p < 0,05) en comparación con su prueba de laboratorio de referencia.Esta discrepancia puede deberse a la sensibilidad de la prueba de referencia para detectar el SARS-CoV-2, y pueden ser importantes estudios adicionales para determinar la causa.
Además, nuestro estudio evaluó el rendimiento comparativo del ensayo SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un excelente porcentaje de concordancia positiva (PPA = 97,9%), porcentaje de concordancia negativa (NPA = 100%) y porcentaje de concordancia general por género (OPA). ). = 98,8%). Los valores Kappa de Cohen mostraron una buena concordancia (K = 0,975). Estudios en los Países Bajos16 y China15 han mostrado resultados consistentes. La prueba SARS-CoV-2 BGI es una prueba de detección de un solo gen (ORF1a/b) que utiliza 10 µl de eluido de amplificación/detección. A pesar de la buena concordancia estadística con nuestros resultados de referencia, el análisis pasó por alto dos muestras positivas (1,22%) de la muestra total. Esto puede tener enormes implicaciones clínicas para la dinámica de transmisión tanto a nivel de pacientes como de la comunidad.
Otro análisis comparativo incluido en este estudio fue el ensayo rRT-PCR (RUO) de Sansure Biotech nCoV-2019; el porcentaje de coincidencia general fue del 96,3 %. La fuerza de concordancia también se determinó mediante el valor Kappa de Cohen, que fue de 0,925, lo que indica una concordancia total con el CRS. Nuevamente, nuestros resultados son idénticos a los de estudios realizados en la Universidad Central del Sur de Changsha (China) y en el Departamento de Laboratorio Clínico del Hospital Popular de Liuzhou (China)17. Aunque se registró la buena concordancia estadística mencionada anteriormente, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo de Sansure Biotech tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (p < 0,005). Aunque se registró la buena concordancia estadística mencionada anteriormente, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo de Sansure Biotech tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (p < 0,005). No es necesario que el dispositivo de seguridad esté disponible según las estadísticas actuales, según el criterio de Макнемара) Por lo general, los resultados del análisis de Sansure Biotech son estadísticos adecuados para la aplicación de CRS (p < 0,005). Aunque se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró que el resultado del ensayo de Sansure Biotech tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0.005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал estadístico значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech y CRS. A pesar de la buena concordancia estadística señalada anteriormente, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,005) entre el ensayo de Sansure Biotech y el CRS.Seis muestras (3,66 %) resultaron ser falsos negativos en comparación con el CRS (Tabla Suplementaria 1); esto es muy importante, especialmente dada la dinámica de transmisión del virus. Los datos anteriores también respaldan esta baja tasa de detección15.
En este estudio, se determinaron los valores de Ct para cada ensayo y plataforma respectiva, con el valor medio de Ct más bajo informado en el ensayo Abbott SARS-CoV-2. Este resultado puede estar relacionado con el sistema de pruebas genéticas combinadas simultáneas de Abbott para la detección de SARS-CoV-2. Por lo tanto, según la Figura 1, el 87,6% de los resultados de Abbott SARS-CoV-2 tuvieron valores de Ct inferiores a 20. Solo un pequeño número de resultados de muestra (12,4%) estaban en el rango de 20 a 30. No se registraron valores de Ct superiores a 30. Además del uso por parte de Abbott del formato de prueba genética del panel SARS-CoV-2, este resultado puede estar relacionado con el límite de detección inferior (32,5 copias de ARN/mL)18, que es tres veces menor que el límite inferior de la compañía de 100 copias de ARN/mL. ml)19.
Este estudio presenta algunas limitaciones: en primer lugar, no disponemos de métodos estándar o de referencia [como la carga viral u otras pruebas de laboratorio (LDA)] debido a la falta de recursos. En segundo lugar, todas las muestras utilizadas en este estudio fueron hisopados nasofaríngeos, mientras que los resultados no fueron aplicables a otros tipos de muestras. En tercer lugar, el tamaño de nuestra muestra fue pequeño.
Este estudio comparó el rendimiento de cuatro ensayos de rRT-PCR para el SARS-CoV-2 utilizando muestras nasofaríngeas. Todos los ensayos de detección tuvieron un rendimiento prácticamente comparable, con la excepción del ensayo de Sansure Biotech. Además, se identificó una baja tasa de positividad en el ensayo de Sansure Biotech en comparación con el CRS (p < 0,05). Además, se identificó una baja tasa de positividad en el ensayo de Sansure Biotech en comparación con el CRS (p < 0,05). Además, en la prueba de Sansure Biotech se encontraron pocos resultados en relación con CRS (p < 0,05). Además, la prueba de Sansure Biotech mostró un bajo porcentaje de resultados positivos en comparación con CRS (p < 0,05).Según CRS y Sansure Biotech (p < 0,05).Según CRS y Sansure Biotech (p < 0,05). Además, el análisis de Sansure Biotech es una gran cantidad de resultados negativos para el CRS (p < 0,05). Además, el ensayo de Sansure Biotech tuvo una tasa de positividad más baja en comparación con CRS (p < 0,05).El análisis de Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA y concordancia general superó el 93,5 %, con un índice de concordancia Cohen Kappa de 0,925. Finalmente, el ensayo de Sansure Biotech (RUO) necesita mayor validación para su uso en Etiopía, y se debe considerar la realización de investigaciones adicionales para evaluar las afirmaciones de cada fabricante.
El diseño comparativo del estudio se llevó a cabo en cuatro centros de salud en Adís Abeba: el Hospital Eka Kotebe, el Centro de Tratamiento de la Iglesia del Milenio, el Hospital Memorial Zewooditu y el Hospital Especialista en Tuberculosis de San Pedro. Los datos se recopilaron entre el 1 y el 31 de diciembre de 2020. Los centros médicos para este estudio se seleccionaron deliberadamente en función de su alto número de casos y la disponibilidad de importantes centros de tratamiento en la ciudad. De igual manera, los instrumentos, incluidos los instrumentos de PCR en tiempo real ABI 7500 y Abbott m2000, se seleccionaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes de reactivos NAAT, y se seleccionaron cuatro kits de detección de PCR para este estudio, ya que la mayoría de los laboratorios en Etiopía utilizaron al menos cuatro de ellos. Prueba genética, prueba Abbott SARS-CoV-2, prueba Sansure Biotech y prueba SARS-CoV-2 BGI realizadas durante el estudio).
Las pruebas de SARS-CoV-2 se realizaron del 1 al 30 de diciembre de 2020 utilizando 3 ml de medio de transporte viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de individuos bajo investigación por COVID-19 remitidos a EPHI. Las muestras nasofaríngeas fueron recolectadas por recolectores de muestras capacitados y enviadas a EPHI en paquetes triples. Antes del aislamiento del ácido nucleico, a cada muestra se le asigna un número de identificación único. La extracción se realiza de cada muestra inmediatamente después de su llegada utilizando métodos de extracción manual y automática. Por lo tanto, para la extracción automática de Abbott m2000, se extrajeron 1,3 ml de la muestra (incluyendo 0,8 ml de volumen muerto y 0,5 ml de volumen de entrada de extracción) de la muestra de cada muestra y se pasaron a través del sistema de preparación de muestras de ADN de Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EE. UU.). ) Se incluyó un lote de 96 [92 muestras, dos controles de detección y dos controles sin plantilla (NTC)] en el proceso general (recuperación y detección) de dos rondas de SARS-CoV-2 (EUA) en tiempo real. minería. De igual manera, para la extracción manual, utilice las mismas muestras (para la extracción y el descubrimiento automáticos). Por lo tanto, a lo largo del proceso, se alicuotaron y extrajeron muestras de 140 µl utilizando el QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) en lotes de 24 (incluyendo 20 muestras, dos controles de ensayo y dos NTC) durante nueve rondas. Los eluidos extraídos manualmente se amplificaron y detectaron utilizando un termociclador ABI 7500 utilizando el ensayo SARS-CoV-2 BGI, el ensayo Daan Gene y el ensayo Sansure Biotech.
El aislamiento y la purificación automatizados del ARN viral del SARS-CoV-2 siguen el principio de microesferas magnéticas utilizando reactivos de preparación de muestras de ADN de Abbott. La inactivación de las muestras y la solubilización de las partículas virales se llevan a cabo utilizando un detergente que contiene isotiocianato de guanidina para desnaturalizar la proteína e inactivar la ARNasa. A continuación, el ARN se separa de la proteína mediante una separación en fase sólida utilizando sílice, es decir, la sal de guanidinio y el pH alcalino del tampón de lisis promueven la unión de los ácidos nucleicos a la sílice (SiO2). El paso de enjuague elimina las proteínas y los residuos restantes para producir una solución transparente. El ARN transparente se aísla de las micropartículas a base de sílice utilizando el campo magnético del instrumento20,21. Por otro lado, el aislamiento y la purificación manual del ARN se llevan a cabo mediante el método de columna de centrifugación utilizando centrifugación en lugar de un soporte magnético y la separación de las micropartículas del eluyente.
La prueba de detección de SARS-CoV-2 en tiempo real de Abbott (Abbott Molecular, Inc.) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que recibió EUA19,22 de la OMS y la FDA. En este protocolo, la inactivación de la muestra antes de la extracción se realizó en un baño de agua a 56 °C durante 30 min. Después de la inactivación del virus, la extracción de ácido nucleico se realizó en un instrumento Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM utilizando un sistema de preparación de muestras de ADN Abbott m2000. según el fabricante. La amplificación y la detección se realizaron utilizando un instrumento Abbott m2000 RT-PCR, y se realizó una detección dual para los genes RdRp y N. ROX) y VIC P (colorante patentado) para la selección y detección de controles internos, lo que permite la detección simultánea de ambos productos de amplificación 19 .
El método de detección de amplificación de este kit se basa en la tecnología RT-PCR de un solo paso. Daan Gene Technology seleccionó los genes ORF1a/b y N como regiones conservadas para detectar la amplificación de la región diana. Se diseñaron cebadores y sondas fluorescentes específicos (sondas del gen N marcadas con FAM y sondas ORF1a/b marcadas con VIC) para detectar el ARN del SARS-CoV-2 en muestras. El eluyente final y las mezclas maestras se prepararon añadiendo 5 µl de eluyente a 20 µl de la mezcla maestra, hasta alcanzar un volumen final de 25 µl. La amplificación y la detección se realizaron simultáneamente en un equipo de PCR en tiempo real ABI 750024.
Los genes ORF1a/b y N se detectaron con el kit de diagnóstico de ácidos nucleicos nCoV-2019 de Sansure Biotech (detección por PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada gen diana seleccionando el canal FAM para la región ORF1a/b y el canal ROX para el gen N. A este kit de ensayo, se añaden el eluyente y los reactivos de la mezcla maestra de la siguiente manera: prepare 30 µl de reactivo de la mezcla maestra y 20 µl de muestra eluida para la detección/amplificación. Se utilizó PCR en tiempo real ABI 750025 para la amplificación/detección.
La prueba SARS-CoV-2 BGI es un kit de PCR en tiempo real fluorescente para el diagnóstico de COVID-19. La región diana se encuentra en la región ORF1a/b del genoma del SARS-CoV-2, lo que permite la detección de un solo gen. Además, el gen constitutivo humano β-actina es un gen diana regulado internamente. La mezcla maestra se prepara mezclando 20 µl del reactivo de la mezcla maestra y 10 µl de la muestra de ARN extraída en una placa de pocillos26. Se utilizó un instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real fluorescente ABI 7500 para la amplificación y la detección. La amplificación de ácidos nucleicos, las condiciones de ejecución de la PCR para cada ensayo y la interpretación de los resultados se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante correspondiente (Tabla 3).
En este análisis comparativo, no utilizamos el método estándar de referencia para determinar el porcentaje de concordancia (positiva, negativa y general) ni otros parámetros de comparación para los cuatro análisis. Cada comparación de pruebas se realizó con CRS; en este estudio, el CRS se estableció mediante la regla "cualquier positivo" y el resultado se determinó, no mediante una sola prueba; utilizamos al menos dos resultados de pruebas coincidentes. Además, en el caso de la transmisión de la COVID-19, los resultados falsos negativos son más peligrosos que los falsos positivos. Por lo tanto, para decir "positivo" con la mayor precisión posible a partir de un resultado de CRS, al menos dos pruebas de ensayo deben ser positivas, lo que significa que es probable que al menos un resultado positivo provenga de un ensayo EUA. Por lo tanto, de cuatro resultados de prueba, dos o más resultados de prueba que dan el mismo resultado se consideran verdaderos positivos o negativos18,27.
Los datos se recopilaron mediante formularios de extracción de datos estructurados, y la entrada y el análisis de datos se realizaron con el programa estadístico Excel y SPSS versión 23.0 para estadística descriptiva. Se analizaron los porcentajes de concordancia positiva, negativa y global, y se utilizó la puntuación kappa para determinar el grado de concordancia de cada método con la CRS. Los valores kappa se interpretan de la siguiente manera: 0,01 a 0,20 para concordancia leve, 0,21 a 0,40 para concordancia general, 0,41 a 0,60 para concordancia moderada, 0,61 a 0,80 para concordancia importante y 0,81 a 0,99 para concordancia completa28.
Se obtuvo la autorización ética de la Universidad de Adís Abeba y todos los protocolos experimentales de este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Científica del Instituto de Salud Pública de Etiopía. El número de referencia de la Licencia de Ética del EPHI es EPHI/IRB-279-2020. Todos los métodos se aplicaron de acuerdo con las recomendaciones y disposiciones de las Directrices Nacionales Integrales de Etiopía para el Tratamiento de la COVID-19. Además, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su participación en el estudio.
Todos los datos obtenidos o analizados en este estudio se incluyen en este artículo publicado. Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles a petición del autor correspondiente.
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