Realización de cuatro ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para identificar el SARS-CoV-2 en Etiopía

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Desde el brote de enfermedad por coronavirus (COVID-19) de 2019, se han desarrollado en todo el mundo muchas pruebas comerciales de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) que se han convertido en ensayos estándar. Aunque rápidamente se desarrollaron y aplicaron varias pruebas a las pruebas de diagnóstico de laboratorio, el rendimiento de estas pruebas no se ha evaluado en diversos entornos. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento de los ensayos Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI y Sansure Biotech utilizando el estándar de referencia compuesto CRS. El estudio se realizó en el Instituto de Salud Pública de Etiopía (EPHI) del 1 al 30 de diciembre de 2020. Se extrajeron 164 muestras nasofaríngeas utilizando el mini kit QIAamp RNA y el sistema de preparación de muestras de ADN Abbott. De 164 muestras, el 59,1% fueron positivas y el 40,9% negativas para CRS. La positividad de Sansure Biotech fue significativamente baja en comparación con CRS (p <0,05). La positividad de Sansure Biotech fue significativamente baja en comparación con CRS (p <0,05). Los resultados de Sansure Biotech no están disponibles en CRS (p < 0,05). Los resultados positivos de Sansure Biotech fueron significativamente menores en comparación con CRS (p <0,05).Según CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05).Según CRS, Sansure Biotech 的阳性率显着较低 (p < 0,05). Sansure Biotech tiene muchos resultados positivos para CRS (p < 0,05). Sansure Biotech tuvo significativamente menos resultados positivos en comparación con CRS (p <0,05).La concordancia general de los cuatro análisis fue del 96,3% al 100% en comparación con la CRS. Además de la baja tasa de positividad del ensayo de Sansure Biotech, el rendimiento de los cuatro ensayos fue casi comparable. Como tal, el ensayo de Sansure Biotech [solo para investigación (RUO)] requiere una validación adicional para su uso en Etiopía. Finalmente, se deben considerar investigaciones adicionales para evaluar ensayos con las afirmaciones apropiadas del fabricante.
Las pruebas de laboratorio forman parte del Plan estratégico de preparación y respuesta (SPRP) de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la preparación y respuesta a la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). La OMS advierte que los países necesitan desarrollar capacidad de laboratorio para mejorar la preparación, la gestión adecuada de casos, la vigilancia y la respuesta rápida a los desafíos de salud pública. Esto sugiere que el papel del laboratorio es clave para caracterizar la enfermedad y la epidemiología de los agentes infecciosos emergentes y controlar su propagación.
El diagnóstico de COVID-19 requiere información epidemiológica y médica, síntomas/signos personales y datos radiográficos y de laboratorio2. Desde que se informó del brote de COVID-19 en Wuhan, China, se han desarrollado muchas pruebas comerciales de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) en todo el mundo. La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) se ha utilizado como método estándar y de rutina para el diagnóstico de laboratorio de la infección por síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2)3. La detección molecular del SARS-CoV-2 generalmente se basa en los genes N (gen de la proteína de la nucleocápside), E (gen de la proteína de la envoltura) y RdRp (gen de la ARN polimerasa dependiente de ARN) en ORF1a/b (marco de lectura abierto 1a/b). . gen) región identificada a partir del genoma viral. Se consideran las principales regiones conservadas que se encuentran en los genomas virales para el reconocimiento de virus4. Entre estos genes, los genes RdRp y E tienen una alta sensibilidad de detección analítica, mientras que el gen N tiene una baja sensibilidad analítica5.
El rendimiento de los ensayos de PCR puede variar dependiendo de varios factores como: reactivos de extracción, reactivos de amplificación/detección, método de extracción, calidad de la máquina de PCR y otros instrumentos. Hasta abril de 2020, más de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nueve países han recibido una Autorización de uso de emergencia (EUA) para el diagnóstico de COVID-196. En Etiopía, se utilizan más de 14 plataformas de PCR en tiempo real para la detección por PCR del SARS-CoV-2 en 26 instituciones de salud pública, incluidas ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 y Quant-studio7. Además, se encuentran disponibles varios kits de pruebas de PCR, como la prueba Daan Gene, la prueba Abbott SARS-CoV-2, la prueba Sansure Biotech y la prueba BGI SARS-CoV-2. Aunque la rRT-PCR es muy sensible, algunos pacientes con COVID-19 informan resultados falsos negativos debido a copias insuficientes de ácido ribonucleico (ARN) viral en las muestras debido a una recolección, transporte, almacenamiento y manipulación inadecuados, y a pruebas de laboratorio. condiciones y acciones del personal8. Además, la mala manipulación de la muestra o el control, el ajuste del umbral del ciclo (Ct) y la reactividad cruzada con otros ácidos nucleicos patógenos o ARN de SARS-CoV-2 inactivo/residual pueden generar resultados falsos positivos en los ensayos rRT-PCR9. Así, está claro que las pruebas de PCR sí pueden identificar a los portadores de fragmentos de genes, ya que ni siquiera pueden distinguir entre genes virales verdaderamente activos, por lo que las pruebas sólo pueden identificar a los portadores y no a los pacientes10. Por tanto, es importante evaluar el rendimiento diagnóstico mediante métodos estándar en nuestro medio. Aunque muchos reactivos NAAT están disponibles en el Instituto de Salud Pública de Etiopía (EPHI) y en todo el país, aún no se ha informado de ninguna evaluación comparativa de su eficacia. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento comparativo de los kits disponibles comercialmente para la detección del SARS-CoV-2 mediante rRT-PCR utilizando muestras clínicas.
En este estudio se incluyeron un total de 164 participantes con sospecha de COVID-19. La mayoría de las muestras procedían de centros de tratamiento (118/164 = 72%), mientras que los 46 participantes restantes (28%) procedían de centros que no eran de tratamiento. Entre los participantes no tratados en el centro, 15 (9,1%) tenían casos clínicamente sospechosos y 31 (18,9%) tenían contactos de casos confirmados. Noventa y tres (56,7%) participantes eran hombres y la edad media (± DE) de los participantes fue de 31,10 (± 11,82) años.
En este estudio se determinaron las tasas positivas y negativas de cuatro pruebas de COVID-19. Por lo tanto, las tasas positivas del ensayo Abbott SARS-CoV-2, el ensayo Daan Gene 2019-nCoV, el ensayo SARS-CoV-2 BGI y el ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV fueron del 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % y 55,5 % respectivamente. . Las puntuaciones positivas y negativas del estándar de referencia compuesto (CRS) fueron 97 (59,1%) y 67 (40,9%), respectivamente (Tabla 1). En este estudio, la definición de CRS se basó en la regla de “cualquier positivo”, según la cual de cuatro resultados de pruebas, dos o más resultados que dieron el mismo resultado se consideraron verdaderos positivos o negativos.
En este estudio, encontramos un acuerdo porcentual negativo (NPA) del 100 % (IC 95 %: 94,6–100) para todos los análisis en comparación con la CRS. El análisis de Sansure Biotechnology mostró un PPA mínimo del 93,8 % (IC del 95 %: 87,2-97,1) y el análisis de Daan Gene 2019-nCoV tuvo una concordancia general del 99,4 % (IC del 95 %: 96,6-99,9). Por el contrario, la concordancia general entre el ensayo BGI de SARS-CoV-2 y el ensayo 2019-nCoV de Sansure Biotech fue del 98,8 % y 96,3 %, respectivamente (Tabla 2).
El coeficiente de concordancia kappa de Cohen entre los resultados del ensayo CRS y Abbott SARS-CoV-2 fue totalmente consistente (K = 1,00). De manera similar, los valores kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI y Sansure Biotech 2019-nCoV también son totalmente consistentes con CRS (K ≥ 0,925). En este análisis comparativo, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró que los resultados del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV fueron significativamente diferentes de los resultados de CRS (p = 0,031) (Tabla 2).
Como se muestra en la Fig.1, el porcentaje del valor Ct más bajo (< 20 Ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp y N combinados) fue del 87,6 % y el valor Ct del gen ORF1a/b del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de bajo El valor de Ct (< 20 Ct) fue del 50,3% y el valor alto de Ct (36–40 Ct) fue 3,2%. 1, el porcentaje del valor Ct más bajo (< 20 Ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp y N combinados) fue del 87,6 % y el valor Ct del gen ORF1a/b del ensayo Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de bajo El valor de Ct (< 20 Ct) fue del 50,3% y el valor alto de Ct (36–40 Ct) fue 3,2%.Como se muestra en la Fig.1, el nombre actual de Ct (< 20 Ct) es del 87,6%, y el Ct gen ORF1a/b es de 87,6%. Análisis de Sansure Biotech 2019-nCoV con una proporción mínima de Ct (< 20 Ct) equivalente al 50,3%, y una proporción inferior de Ct (36–40 Ct) 3,2%. 1, el porcentaje del análisis del valor Ct más bajo (< 20 Ct) de Abbott SARS-CoV-2 (gen combinado RdRp y N) fue del 87,6 %, y el valor Ct del análisis del gen ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV mostró que el porcentaje de Ct de bajo valor (< 20 Ct) representó el 50,3%, y el de alto valor Ct (36-40 Ct) representó el 3,2%.1 año, Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct）为87.6%，Sansure Biotech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36–40 Ct)的百分比为3.2%。 Como se muestra en la Figura 1, el porcentaje de valor Ct más bajo (< 20 Ct) de la prueba Abbott SARS-CoV-2 (combinación de gen RdRp y N) es del 87,6 %, el valor Ct del gen ORF1a/b de la prueba Sansure Biotech 2019-nCoV muestra un Ct bajo (< 20 Ct) y el porcentaje es 50,3%, Ct El porcentaje de (36–40 Ct) es del 3,2%. Como parte del riesgo 1, el análisis de Abbott SARS-CoV-2 (géneros RdRp y N) es el mismo que el actual Ct (< 20 Ct) en el área 87,6%, según Ct gena ORF1a/b en el informe Sansure Biotech 2019- Análisis nCoV показал низкий Ct. Como se muestra en la Figura 1, el ensayo Abbott SARS-CoV-2 (que combina los genes RdRp y N) tuvo el valor Ct porcentual más bajo (< 20 Ct) con un 87,6 %, mientras que el valor Ct del gen ORF1a/b en el ensayo Sansure Estudio Biotech 2019 – El análisis de nCoV mostró un Ct bajo. El tamaño más grande (< 20 Ct) equivale al 50,3%, el más alto (36–40 Ct) aproximadamente al 3,2%. El porcentaje de valores (< 20 Ct) fue del 50,3% y el porcentaje de valores altos de Ct (36-40 Ct) fue del 3,2%.La prueba Abbott SARS-CoV-2 B registró valores de Ct superiores a 30. Por otro lado, en el ensayo BGI SARS-CoV-2 el gen ORF1a/b tuvo un valor de Ct alto (> 36 Ct), el porcentaje fue del 4% (Fig. 1). Por otro lado, en el ensayo BGI SARS-CoV-2 el gen ORF1a/b tuvo un valor de Ct alto (> 36 Ct), el porcentaje fue del 4% (Fig. 1). С другой стороны, en el análisis de BGI SARS-CoV-2 gen ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составлял 4% (risa. 1). Por otro lado, en el análisis del gen BGI SARS-CoV-2 ORF1a/b tuvo un valor de Ct alto (> 36 Ct), cuyo porcentaje fue del 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为4%（图1）。 Por otro lado, en la detección de BGI SARS-CoV-2, el porcentaje del gen ORF1a/b con valor de Ct alto (>36 Ct) es del 4% (Figura 1). С другой стороны, анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) sostavil 4% (risa. 1). Por otro lado, en el análisis BGI SARS-CoV-2, el porcentaje de genes ORF1a/b con valores de Ct elevados (>36 Ct) fue del 4% (Fig. 1).
En este estudio, tomamos 164 muestras nasofaríngeas. Para todo tipo de ensayos, el aislamiento y amplificación del ARN se realizó utilizando los métodos y kits recomendados por los respectivos fabricantes.
Este estudio demostró que la prueba de Abbott para el SARS-CoV-2 tiene el mismo rendimiento de detección que la CRS, con una concordancia general, positiva y negativa del 100 %. El acuerdo kappa de Cohen es 1,00, lo que indica un acuerdo total con CRS. Un estudio similar realizado por la Universidad de Washington en EE.UU. encontró que la sensibilidad y especificidad general de la prueba de Abbott para SARS-CoV-2 era del 93% y 100%, respectivamente, en comparación con el ensayo determinado en laboratorio (LDA) de los CDC. . 11. El sistema de detección de Abbott SARS-CoV-2 se basa en la detección combinada simultánea de los genes N y RdRp, ya que ambos genes son más sensibles, minimizando los falsos negativos12. Un estudio realizado en Viena, Austria, también demostró que grandes volúmenes de muestras de extracción y volúmenes de eluyente de detección minimizaban los efectos de dilución y aumentaban la eficiencia de la detección13. Por lo tanto, la combinación perfecta de Abbott para el ensayo SARS-CoV-2 puede asociarse con un sistema de detección de plataforma que detecta simultáneamente genes combinatorios, extrae una gran cantidad de muestras (0,5 ml) y utiliza una gran cantidad de eluyente (40 µl).
Nuestros resultados también mostraron que el rendimiento de detección de la prueba genética de Daan fue casi el mismo que el de CRS. Esto es consistente con un estudio14 realizado en la Universidad de Anhui en Huainan, China, y la afirmación del fabricante de un acuerdo 100% positivo. A pesar de los informes de resultados consistentes, una muestra dio un falso negativo después de volver a analizar el mismo eluato, pero fue positiva en los ensayos Abbott SARS-CoV-2 y Sansure Biotech nCoV-2019. Esto sugiere que puede haber variabilidad en los resultados entre diferentes tipos de ensayos. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo Daan Gene fue significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con su ensayo de referencia definido en laboratorio. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo Daan Gene fue significativamente diferente (p < 0,05) en comparación con su ensayo de referencia definido en laboratorio. No lo mencioné, en el estudio, proporcionado por Kita15, el análisis de los resultados de Daan Gene fue exclusivo (p < 0,05) de este análisis de laboratorio. Sin embargo, en un estudio realizado en China15, el resultado del análisis de Daan Gene fue significativamente diferente (p < 0,05) de su análisis de referencia de laboratorio.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p <0,05）。然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Sin embargo, en un estudio realizado en China15, los resultados de la prueba genética de Daan fueron significativamente diferentes (p < 0,05) en comparación con su prueba de laboratorio de referencia.Esta discrepancia puede deberse a la sensibilidad de la prueba de referencia para detectar el SARS-CoV-2, y puede ser importante realizar más estudios para determinar la causa.
Además, nuestro estudio evaluó el rendimiento comparativo del ensayo BGI del SARS-CoV-2 con CRS, mostrando un excelente porcentaje de acuerdo positivo (PPA = 97,9%), un acuerdo porcentual negativo (NPA = 100%) y un acuerdo porcentual general por género ( OPA). ). = 98,8%). Los valores Kappa de Cohen mostraron una buena concordancia (K = 0,975). Estudios realizados en los Países Bajos16 y China15 han mostrado resultados consistentes. La prueba BGI del SARS-CoV-2 es una prueba de detección de un solo gen (ORF1a/b) que utiliza 10 µl de eluato de amplificación/detección. A pesar de la buena concordancia estadística con nuestros resultados de referencia, el análisis omitió dos muestras positivas (1,22%) de la muestra total. Esto puede tener enormes implicaciones clínicas para la dinámica de transmisión tanto a nivel del paciente como de la comunidad.
Otro análisis comparativo incluido en este estudio fue el ensayo nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) de Sansure Biotech; el porcentaje general de coincidencia fue del 96,3%. La fuerza del acuerdo también estuvo determinada por el valor Kappa de Cohen, que fue de 0,925, lo que indica un acuerdo total con el CRS. Nuevamente, nuestros resultados son idénticos a los estudios realizados en la Universidad Central Sur en Changsha, China, y en el Departamento de Laboratorio Clínico del Hospital Popular de Liuzhou, ciudad de Liuzhou, China17. Aunque se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo de Sansure Biotech tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (p < 0,005). Aunque se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo de Sansure Biotech tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (p < 0,005). No es necesario que el dispositivo de seguridad esté disponible según las estadísticas actuales, según el criterio de Макнемара) показал, что ресультат анализа Sansure Biotech имеее статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005). Aunque se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró que el resultado del ensayo de Sansure Biotech tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech 检测的结果与CRS相比具有统计学显着差异（p < 0.005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， ， sansure biotech 检测 结果 与 crs相比 具有 显着 （（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал Clasificación estadística completa (p < 0,005) mediante análisis de Sansure Biotech y CRS. A pesar de la buena concordancia estadística mencionada anteriormente, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró una diferencia estadísticamente significativa (p <0,005) entre el ensayo de Sansure Biotech y el CRS.Se encontró que seis muestras (3,66%) eran falsos negativos en comparación con CRS (Tabla complementaria 1); Esto es muy importante, especialmente dada la dinámica de transmisión del virus. Los datos anteriores también respaldan esta baja tasa de detección15.
En este estudio, se determinaron los valores de Ct para cada ensayo y plataforma respectiva, y el valor medio de Ct más bajo se informó en el ensayo Abbott SARS-CoV-2. Este resultado puede estar relacionado con el sistema de pruebas genéticas combinadas simultáneas de Abbott para la detección del SARS-CoV-2. Por lo tanto, según la Figura 1, el 87,6 % de los resultados de Abbott SARS-CoV-2 tenían valores de Ct inferiores a 20. Solo una pequeña cantidad de resultados de muestra (12,4 %) estaban en el rango de 20 a 30. No se registraron valores de Ct superiores a 30. Además del uso por parte de Abbott del formato de prueba genética del panel SARS-CoV-2, este resultado puede estar relacionado con el límite inferior de detección (32,5 copias de ARN/mL)18, que es tres veces menor que el límite inferior de la compañía de 100 copias de ARN. /ml. ml)19.
Este estudio tiene algunas limitaciones: en primer lugar, no contamos con métodos estándar/de referencia [como la carga viral u otras pruebas de laboratorio (LDA)] por falta de recursos. En segundo lugar, todas las muestras utilizadas en este estudio fueron hisopos nasofaríngeos, mientras que los resultados no fueron aplicables a otros tipos de muestras y, en tercer lugar, el tamaño de nuestra muestra fue pequeño.
Este estudio comparó el rendimiento de cuatro ensayos rRT-PCR para SARS-CoV-2 utilizando muestras nasofaríngeas. Todos los ensayos de detección tuvieron un rendimiento casi comparable, con la excepción del ensayo de Sansure Biotech. Además, se identificó una baja tasa de positividad en el ensayo de Sansure Biotech en comparación con el CRS (p < 0,05). Además, se identificó una baja tasa de positividad en el ensayo de Sansure Biotech en comparación con el CRS (p < 0,05). Además, en la prueba de Sansure Biotech se encontraron pocos resultados en relación con CRS (p < 0,05). Además, la prueba Sansure Biotech mostró un bajo porcentaje de resultados positivos en comparación con CRS (p < 0,05).Según CRS y Sansure Biotech (p < 0,05).Según CRS y Sansure Biotech (p < 0,05). Además, el análisis de Sansure Biotech es una gran cantidad de resultados negativos para el CRS (p < 0,05). Además, el ensayo de Sansure Biotech tuvo una tasa de positividad más baja en comparación con CRS (p <0,05).El análisis de Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA y acuerdo general superó el 93,5 % con un valor de fuerza de acuerdo Cohen Kappa de 0,925. Finalmente, el ensayo Sansure Biotech (RUO) necesita mayor validación para su uso en Etiopía, y se deben considerar investigaciones adicionales para evaluar las afirmaciones de los fabricantes individuales.
El diseño del estudio comparativo se realizó en cuatro centros de salud en Addis Abeba, el Hospital Eka Kotebe, el Centro de Tratamiento de la Iglesia Millennium, el Hospital Memorial Zewooditu y el Hospital Especialista en Tuberculosis St. Peter. Los datos se recopilaron entre el 1 y el 31 de diciembre de 2020. Las instalaciones médicas para este estudio se eligieron intencionalmente en función de su alto número de casos y la disponibilidad de los principales centros de tratamiento en la ciudad. De manera similar, los instrumentos, incluidos los instrumentos de PCR en tiempo real ABI 7500 y Abbott m2000, se seleccionaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes de reactivos NAAT, y se seleccionaron cuatro kits de detección de PCR para este estudio, ya que la mayoría de los laboratorios en Etiopía usaban al menos cuatro de ellos. Prueba genética, prueba Abbott SARS-CoV-2, prueba Sansure Biotech y prueba BGI SARS-CoV-2 realizadas durante el estudio).
Las pruebas de SARS-CoV-2 se realizaron del 1 al 30 de diciembre de 2020 utilizando 3 ml de medio de transporte viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, China) de personas bajo investigación por COVID-19 remitidas al EPHI. Las muestras nasofaríngeas fueron recolectadas por recolectores de muestras capacitados y enviadas al EPHI en paquetes triples. Antes del aislamiento del ácido nucleico, a cada muestra se le asigna un número de identificación único. La extracción se realiza de cada muestra inmediatamente después de su llegada mediante métodos de extracción manuales y automáticos. Por lo tanto, para la extracción automática de Abbott m2000, se extrajeron 1,3 ml (incluidos 0,8 ml de volumen muerto y 0,5 ml de volumen de entrada de extracción) de cada muestra y se pasaron a través del sistema de preparación de muestras de ADN de Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EE.UU.). ) Se incluyó un lote de 96 [92 muestras, dos controles de detección y dos controles sin plantilla (NTC)] en el proceso general (recuperación y detección) de dos rondas de SARS-CoV-2 (EUA) en tiempo real. minería. De manera similar, para la extracción manual, utilice las mismas muestras (para la extracción y el descubrimiento automáticos). Por lo tanto, durante todo el proceso, se dividieron en alícuotas de muestras de 140 µl y se extrajeron utilizando el mini kit QIAamp Viral RNA (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) en lotes de 24 (incluidas 20 muestras, dos controles de ensayo y dos NTC) en nueve rondas. Los eluatos extraídos manualmente se amplificaron y detectaron utilizando un ciclador térmico ABI 7500 mediante el ensayo BGI de SARS-CoV-2, el ensayo Daan Gene y el ensayo Sansure Biotech.
El aislamiento y la purificación automatizados del ARN viral del SARS-CoV-2 siguen el principio de las perlas magnéticas utilizando reactivos de preparación de muestras de ADN de Abbott. La inactivación de muestras y la solubilización de partículas virales se lleva a cabo utilizando un detergente que contiene isotiocianato de guanidina para desnaturalizar la proteína e inactivar la RNasa. A continuación, el ARN se separa de la proteína mediante separación en fase sólida utilizando sílice, es decir, la sal de guanidinio y el pH alcalino del tampón de lisis promueven la unión de los ácidos nucleicos a la sílice (SiO2). El paso de enjuague elimina las proteínas y los desechos restantes para producir una solución transparente. El ARN transparente se aísla de micropartículas a base de sílice utilizando el campo magnético del instrumento20,21. Por otro lado, el aislamiento y purificación manual del ARN se realiza mediante el método de columna de centrifugación utilizando centrifugación en lugar de soporte magnético y separación de micropartículas del eluyente.
La prueba de detección de SARS-CoV-2 en tiempo real de Abbott (Abbott Molecular, Inc.) se realizó según las instrucciones del fabricante, que recibió EUA19,22 de la OMS y la FDA. En este protocolo, la inactivación de la muestra antes de la extracción se realizó en un baño de agua a 56 °C durante 30 min. Después de la inactivación del virus, se realizó la extracción de ácido nucleico en un instrumento Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM utilizando un sistema de preparación de muestras de ADN Abbott m2000. según el fabricante. La amplificación y la detección se realizaron utilizando un instrumento de RT-PCR Abbott m2000 y se realizó una detección dual para los genes RdRp y N. ROX) y VIC P (tinte patentado) para la focalización y detección de controles internos, lo que permite la detección simultánea de ambos productos de amplificación 19 .
El método de detección por amplificación de este kit se basa en la tecnología RT-PCR de un solo paso. Los genes ORF1a/b y N fueron seleccionados como regiones conservadas por Daan Gene Technology para detectar la amplificación de la región objetivo. Se han diseñado cebadores específicos y sondas fluorescentes (sondas del gen N marcadas con FAM, sondas ORF1a/b marcadas con VIC) para detectar el ARN del SARS-CoV-2 en muestras. El eluyente final y las mezclas maestras se prepararon agregando 5 µl de eluyente a 20 µl de la mezcla maestra hasta un volumen final de 25 µl. La amplificación y la detección se realizaron simultáneamente en un instrumento de PCR en tiempo real ABI 750024.
Los genes ORF1a/b y N se detectaron utilizando el kit de diagnóstico de ácido nucleico nCoV-2019 de Sansure Biotech (detección por PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada gen objetivo seleccionando el canal FAM para la región ORF1a/b y el canal ROX para el gen N. A este kit de ensayo, se añaden el eluyente y los reactivos de la mezcla maestra de la siguiente manera: prepare 30 µl de reactivo de la mezcla maestra y 20 µl de muestra eluida para detección/amplificación. Se utilizó PCR en tiempo real ABI 750025 para la amplificación/detección.
La prueba SARS-CoV-2 BGI es un kit fluorescente de rRT-PCR en tiempo real para el diagnóstico de COVID-19. La región objetivo está ubicada en la región ORF1a/b del genoma del SARS-CoV-2, que es un método de detección de un solo gen. Además, el gen constitutivo humano β-actina es un gen diana regulado internamente. La mezcla maestra se prepara mezclando 20 µl del reactivo de la mezcla maestra y 10 µl de la muestra de ARN extraída en una placa de pocillos26. Se utilizó un instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real fluorescente ABI 7500 para la amplificación y detección. Toda la amplificación de ácidos nucleicos, las condiciones de ejecución de la PCR para cada ensayo y la interpretación de los resultados se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante respectivo (Tabla 3).
En este análisis comparativo, no utilizamos el método estándar de referencia para determinar el porcentaje de acuerdo (positivo, negativo y general) ni otros parámetros de comparación para los cuatro análisis. Cada comparación de pruebas se realizó con CRS, en este estudio el CRS se estableció según la regla "cualquier positivo" y el resultado se determinó, no mediante una sola prueba, utilizamos al menos dos resultados de pruebas coincidentes. Además, en el caso de la transmisión de COVID-19, los resultados falsos negativos son más peligrosos que los resultados falsos positivos. Por lo tanto, para decir "positivo" con la mayor precisión posible a partir de un resultado de CRS, al menos dos pruebas de ensayo deben ser positivas, lo que significa que es probable que al menos un resultado positivo provenga de un ensayo de EUA. Por lo tanto, de cuatro resultados de pruebas, dos o más resultados que dan el mismo resultado se consideran verdaderos positivos o negativos18,27.
Los datos se recolectaron mediante formularios estructurados de extracción de datos, el ingreso y análisis de datos se realizaron utilizando el software estadístico Excel y SPSS versión 23.0 para estadística descriptiva. Se analizó el porcentaje de acuerdo positivo, negativo y general, y se utilizó una puntuación Kappa para determinar el grado de acuerdo de cada método con CRS. Los valores de kappa se interpretan de la siguiente manera: 0,01 a 0,20 para un acuerdo leve, 0,21 a 0,40 para un acuerdo general, 0,41-0,60 para un acuerdo moderado, 0,61-0,80 para un acuerdo mayor y 0,81-0,99 para un acuerdo completo28.
Se obtuvo la autorización ética de la Universidad de Addis Abeba y todos los protocolos experimentales para este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión de Ética Científica del Instituto de Salud Pública de Etiopía. El número de referencia de la Licencia de Ética EPHI es EPHI/IRB-279-2020. Todos los métodos se aplicaron de acuerdo con las recomendaciones y disposiciones de las Directrices Nacionales Integrales de Etiopía para el Tratamiento de COVID-19. Además, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes del estudio antes de participar en el estudio.
Todos los datos obtenidos o analizados en este estudio se incluyen en este artículo publicado. Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles del autor respectivo previa solicitud razonable.
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