Rendimiento de cuatro ensayos de amplificación de ácido nucleico para identificar SARS-CoV-2 en Etiopía

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Desde el brote de la enfermedad del coronavirus 2019 (CoVID-19), muchas pruebas de amplificación de ácido nucleico comercial (NAAT) se han desarrollado en todo el mundo y se han convertido en ensayos estándar. Aunque varias pruebas se desarrollaron y se aplicaron rápidamente a las pruebas de diagnóstico de laboratorio, el rendimiento de estas pruebas no se ha evaluado en una variedad de entornos. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento de los ensayos de biotecnología de Abbott SARS-CoV-2, Daan, BGI y Sansure Biotech utilizando el estándar de referencia compuesto (CRS). El estudio se realizó en el Instituto de Salud Pública Etíope (EPHI) del 1 al 30 de diciembre de 2020. Se extrajeron 164 muestras nasofaríngeas utilizando el KIT QIAAMP RNA Mini Kit y el Sistema de Preparación de Muestra de ADN de Abbott. De 164 especímenes, el 59.1% fueron positivos y el 40.9% fueron negativos para CRS. La positividad de la biotecnología de Sansure fue significativamente baja en comparación con CRS (P <0.05). La positividad de la biotecnología de Sansure fue significativamente baja en comparación con CRS (P <0.05). Положительные рлльтата Sansure Biotech ыли значительно ниже по сравнению с CRS (P <0,05). Los resultados positivos de Sansure Biotech fueron significativamente más bajos en comparación con CRS (P <0.05).与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低（ P <0.05 ）。与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 的阳性率显着较低（ P <0.05 ）。 Sansure biotech ыло значительно меншor положительных рлльтата regalo La biotecnología de Sansure tuvo significativamente menos resultados positivos en comparación con CRS (P <0.05).El acuerdo general de los cuatro análisis fue del 96.3-100% en comparación con CRS. Además de la baja tasa de positividad del ensayo de biotecnología de Sansure, el rendimiento de los cuatro ensayos fue casi comparable. Como tal, el ensayo de biotecnología de Sansure [solo investigación (RUO)] requiere una validación adicional para su uso en Etiopía. Finalmente, se debe considerar una investigación adicional para evaluar los ensayos con las reclamaciones apropiadas del fabricante.
Las pruebas de laboratorio son parte del plan estratégico de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la enfermedad del coronavirus 2019 (Covid-19) Preparación y respuesta (SPRP). La OMS aconseja que los países necesitan construir capacidad de laboratorio para mejorar la preparación, la gestión de casos adecuada, la vigilancia y la rápida respuesta a los desafíos de salud pública. Esto sugiere que el papel del laboratorio es clave para caracterizar la enfermedad y la epidemiología de los agentes infecciosos emergentes y controlar su propagación.
El diagnóstico de COVID-19 requiere información epidemiológica y médica, síntomas/signos personales y datos radiográficos y de laboratorio2. Dado que el brote de Covid-19 se informó en Wuhan, China, se han desarrollado muchas pruebas de amplificación de ácido nucleico comercial (NAATS) en todo el mundo. La reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (RRT-PCR) se ha utilizado como un método de rutina y estándar para el diagnóstico de laboratorio de infección severa del síndrome respiratorio agudo 2 (SARS-CoV-2) 3. La detección molecular de SARS-CoV-2 se basa típicamente en los genes de N (gen de proteína nucleocapsídica), E (gen de proteína de envoltura) y RDRP (gen de ARN polimerasa dependiente de ARN) en ORF1A/B (marco de lectura abierto 1A/B). gen) región identificada del genoma viral. Se consideran las principales regiones conservadas que se encuentran en los genomas virales para el reconocimiento de virus4. Entre estos genes, los genes RDRP y E tienen una alta sensibilidad a la detección analítica, mientras que el gen N tiene baja sensibilidad analítica5.
El rendimiento de los ensayos de PCR puede variar según varios factores tales como: reactivos de extracción, reactivos de amplificación/detección, método de extracción, calidad de la máquina PCR y otros instrumentos. A partir de abril de 2020, más de 48 dispositivos de diagnóstico diferentes de nueve países han recibido autorización de uso de emergencia (EUA) para el diagnóstico CoVID-196. En Etiopía, más de 14 plataformas de PCR en tiempo real se utilizan para la detección de PCR de SARS-CoV-2 en 26 instituciones de salud pública, incluidas ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 y Quant-Studio7. Además, hay varios kits de prueba de PCR disponibles, como la prueba de genes Daan, la prueba Abbott SARS-CoV-2, la prueba de biotecnología de Sansure y la prueba BGI SARS-CoV-2. Aunque la RRT-PCR es altamente sensible, algunos pacientes con COVID-19 informan resultados falsos negativos debido a copias insuficientes de ácido ribonucleico viral (ARN) en muestras debido a una recolección incorrecta, transporte, almacenamiento y manejo, y pruebas de laboratorio. Condiciones y acciones del personal8. Además, el mal manejo de la muestra o el control del umbral del ciclo (TC) y la reactividad cruzada con otros ácidos nucleicos patógenos o el ARN SARS-CoV-2 inactivo/residual puede conducir a resultados falsos positivos en los ensayos RRT-PCR9. Por lo tanto, está claro que las pruebas de PCR pueden identificar portadores de fragmentos de genes, ya que ni siquiera pueden distinguir entre genes virales verdaderamente activos, por lo que las pruebas solo pueden identificar portadores y no pacientes10. Por lo tanto, es importante evaluar el rendimiento del diagnóstico utilizando métodos estándar en nuestro entorno. Aunque muchos reactivos NAAT están disponibles en el Instituto de Salud Pública Etíope (EPHI) y en todo el país, todavía no se ha informado una evaluación comparativa de su efectividad. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento comparativo de los kits disponibles comercialmente para la detección de SARS-CoV-2 por RRT-PCR utilizando muestras clínicas.
En este estudio se incluyeron un total de 164 participantes con sospecha de Covid-19. La mayoría de las muestras fueron de centros de tratamiento (118/164 = 72%), mientras que los 46 (28%) participantes restantes eran de centros de no tratamiento. Entre los participantes no tratados en el centro, 15 (9.1%) tenían casos clínicamente sospechosos y 31 (18.9%) tenían contactos de casos confirmados. Noventa y tres (56.7%) participantes eran hombres, y la edad media (± DE) de los participantes fue de 31.10 (± 11.82) años.
En este estudio, se determinaron tasas positivas y negativas de cuatro pruebas para CoVID-19. Por lo tanto, las tasas positivas del ensayo Abbott SARS-CoV-2, el ensayo DAAN Gene 2019-NCOV, el ensayo SARS-CoV-2 BGI y el ensayo Sansure Biotech 2019-NCOV fueron 59.1%, 58.5%, 57.9% y 55.5% respectivamente. Las puntuaciones estándar de referencia compuesta positiva y negativa (CRS) fueron 97 (59.1%) y 67 (40.9%), respectivamente (Tabla 1). En este estudio, la definición de CRS se basó en la regla "cualquier positiva", por la cual de los cuatro resultados de las pruebas, dos o más resultados de las pruebas que dieron el mismo resultado se consideraron verdaderos positivos o negativos.
En este estudio, encontramos un acuerdo porcentual negativo (NPA) del 100% (IC 95% 94.6-100) para todos los análisis en comparación con CRS. El análisis de biotecnología de transición mostró un PPA mínimo de 93.8% (IC 95% 87.2-97.1) y el análisis Daan Gene 2019-NCOV tuvo un acuerdo general de 99.4% (IC 95% 96.6-99.9). En contraste, el acuerdo general entre el ensayo SARS-CoV-2 BGI y el ensayo Sansure Biotech 2019-NCOV fue de 98.8% y 96.3%, respectivamente (Tabla 2).
El coeficiente de acuerdo Kappa de Cohen entre los resultados del ensayo CRS y Abbott SARS-CoV-2 fue completamente consistente (k = 1.00). Del mismo modo, los valores de Kappa de Cohen detectados por Daan Gene 2019-NCOV, SARS-CoV-2 BGI y Sansure Biotech 2019-NCOV también son totalmente consistentes con CRS (K ≥ 0.925). En este análisis comparativo, la prueba de chi-cuadrado (prueba McNemar) mostró que los resultados del ensayo de Sansure Biotech 2019-NCOV fueron significativamente diferentes de los resultados de CRS (P = 0.031) (Tabla 2).
Como se muestra en la Fig.1 El porcentaje del valor CT más bajo (<20 ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen combinado RDRP y N gen) fue del 87.6% y el valor de CT del gen ORF1A/B del ensayo Sansure BioTech 2019-NCOV mostró que el porcentaje de bajo valor de CT (<20 CT) fue de 50.3% y el alto valor CT (36-40 CT) fue 3.2%. 1 El porcentaje del valor CT más bajo (<20 ct) del ensayo Abbott SARS-CoV-2 (gen combinado RDRP y N gen) fue del 87.6% y el valor de CT del gen ORF1A/B del ensayo Sansure BioTech 2019-NCOV mostró que el porcentaje de bajo valor de CT (<20 CT) fue de 50.3% y el alto valor CT (36-40 CT) fue 3.2%.Como se muestra en la Fig.1, прiscermo Orf1a/b анализа sansure Biotech 2019-ncov показало что процент низкого значения ct (<20 ct) состаYл 50,3%, сотавumpnл 3,2%. 1, el porcentaje del análisis de valor CT más bajo (<20 ct) de Abbott SARS-COV-2 (gen combinado RDRP y N) fue del 87,6%, y el valor de CT del análisis de genes ORF1A/B de SANSURE BIOTech 2019-NCOV mostró que el porcentaje de bajo valor de CT (<20 CT) contabilizado por 50.3%, y alto valor CT (36-40 CT) mostró que el valor de CT bajo (<20 CT) contabilizado para 50.3%, y alto valor CT (36-40 CT) mostró que el valor de CT bajo (<20 CT) contabilizado por 50.3%y alto valor CT (36-40 CT) mostró que el valor de CT bajo (<20 CT) contabilizado por 50.3%y alto valor CT (36-40 CT) mostró que el valor de CT bajo (<20 CT) contabilizado por 50.3%, y alto valor CT (36-40 CT).如图 1 所示 ， Abbott Sars-Cov-2 检测（结合 RDRP 和 N 基因）的最低 CT 值百分比（ <20 CT ）为 87.6%， Sansure Biotech 2019-NCOV 检测的 ORF1A/B 基因 CT 值显示低 CT 值 (<20 CT) 的百分比为 50.3%， 高 CT 值 (36-40 CT) 的百分比为 3.2%。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 As shown in Figure 1, the lowest Ct value percentage (< 20 Ct) of Abbott SARS-CoV-2 test (combination of RdRp and N gene) is 87.6%, the ORF1a/b gene Ct value of Sansure Biotech 2019-nCoV test shows low Ct值(< 20 Ct) 的 percentage is 50.3%, 高Ct 值(36–40 Ct) 的 percentage is 3.2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott Sars-Cov-2 (сетающий гены rdrp и n) и mec. разере 87,6%, аначение ct гена orf1a/b в исследовании sansure biotech 2019- анализ ncov п калал низкий ct. Como se muestra en la Figura 1, el ensayo Abbott SARS-CoV-2 (que combina los genes RDRP y N) tuvo el valor porcentual de CT más bajo (<20 ct) a 87.6%, mientras que el valor de CT del gen ORF1A/B en el estudio de Biotech de Sansure Biotech 2019: el análisis de NCOV mostró una TC baja. Процент значений (<20 ct) состаículos 50,3%, а процент выыхих значений ct (36–40 ct) составил 3,2%. El porcentaje de valores (<20 ct) fue del 50,3%, y el porcentaje de valores de CT altos (36–40 ct) fue de 3.2%.La prueba Abbott SARS-COV-2 B registró valores de CT por encima de 30. Por otro lado, en el ensayo BGI SARS-COV-2 ORF1A/B el gen tenía un alto valor de CT (> 36 CT) fue del 4% (Fig. 1). Por otro lado, en el ensayo BGI SARS-COV-2 ORF1A/B el gen tenía un alto valor de CT (> 36 CT) fue del 4% (Fig. 1). С друг й стны, в анализе bgi sars-cov-2 ген orf1a/b им; Por otro lado, en el análisis del gen BGI SARS-CoV-2 ORF1A/B tenía un alto valor de CT (> 36 ct), cuyo porcentaje fue del 4% (Fig. 1).另一方面 ， 在 BGI SARS-CoV-2 检测中 ， ORF1A/B 基因具有高 CT 值（> 36 CT ）的百分比为 4%（图 1 ）。 Por otro lado, en la detección BGI SARS-CoV-2, el porcentaje del gen ORF1A/B con un alto valor CT (> 36 ct) es del 4% (Figura 1). Д друг й соны, в анализе bgi sars-Cov-2 процент генов orf1a/b с выыииejo значениiego ct (> 36 ct) соттrero 4% (рple. 1). Por otro lado, en el análisis BGI SARS-CoV-2, el porcentaje de genes ORF1A/B con valores de TC altos (> 36 ct) fue del 4% (Fig. 1).
En este estudio, tomamos 164 muestras nasofaríngeas. Para todos los tipos de ensayos, el aislamiento y la amplificación de ARN se realizaron utilizando los métodos y kits recomendados por los respectivos fabricantes.
Este estudio demostró que la prueba de Abbott para SARS-CoV-2 tiene el mismo rendimiento de detección que CRS, con concordancia 100% positiva, negativa y general. El acuerdo Kappa de Cohen es 1.00, lo que indica un acuerdo completo con CRS. Un estudio similar de la Universidad de Washington en los EE. UU. Encontró que la sensibilidad general y la especificidad de la prueba de Abbott para SARS-CoV-2 fue del 93% y 100%, respectivamente, en comparación con el ensayo determinado de laboratorio (LDA) de los CDC. 11. El sistema de detección Abbott SARS-CoV-2 se basa en la detección combinada simultánea de los genes N y RDRP, ya que ambos genes son más sensibles, minimizando los falsos negativos12. Un estudio en Viena, Austria, también mostró que los grandes volúmenes de muestra de extracción y los volúmenes eluyentes de detección minimizaron los efectos de dilución y una mayor eficiencia de detección13. Por lo tanto, la combinación perfecta de Abbott para el ensayo SARS-CoV-2 puede asociarse con un sistema de detección de plataforma que detecta simultáneamente genes combinatorios, extrae una gran cantidad de muestras (0.5 ml) y utiliza una gran cantidad de eluyente (40 µl).
Nuestros resultados también mostraron que el rendimiento de detección de la prueba genética DAAN fue casi el mismo que el de CRS. Esto es consistente con un estudio14 realizado en la Universidad de Anhui en Huainan, China, y el reclamo del fabricante de un acuerdo 100% positivo. A pesar de los informes de resultados consistentes, una muestra fue falsa negativa después de volver a probar el mismo eluato, pero fue positivo en los ensayos Abbott SARS-CoV-2 y Sansure Biotech NCOV-2019. Esto sugiere que puede haber una variabilidad en los resultados en diferentes tipos de ensayos. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo del gen DAAN fue significativamente diferente (p <0.05) en comparación con su ensayo de referencia definido por laboratorio. Sin embargo, en el estudio realizado en China15, el resultado del ensayo del gen DAAN fue significativamente diferente (p <0.05) en comparación con su ensayo de referencia definido por laboratorio. Теее не менее, determe " Sin embargo, en un estudio en China15, el resultado del análisis del gen DAAN fue significativamente diferente (P <0.05) de su análisis de referencia de laboratorio.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（ p <0.05 ）。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0.05 Однак interest сравнению с ео эээннныífulo лабораeccion. Sin embargo, en un estudio en China15, los resultados de la prueba genética de Daan fueron significativamente diferentes (P <0.05) en comparación con su prueba de laboratorio de referencia.Esta discrepancia puede deberse a la sensibilidad de la prueba de referencia para detectar SARS-CoV-2, y los estudios adicionales pueden ser importantes para determinar la causa.
Además, nuestro estudio evaluó el rendimiento comparativo del ensayo SARS-CoV-2 BGI con CRS, mostrando un excelente acuerdo porcentual positivo (PPA = 97.9%), acuerdo porcentual negativo (NPA = 100%) y un acuerdo porcentual general por género (OPA). ). = 98.8%). Los valores de Kappa de Cohen mostraron un buen acuerdo (k = 0.975). Los estudios en los Países Bajos16 y China15 han mostrado resultados consistentes. La prueba SARS-CoV-2 BGI es una prueba de detección de un solo gen (ORF1A/B) utilizando 10 µl de amplificación/detección de eluato. A pesar del buen acuerdo estadístico con nuestros resultados de referencia, el análisis perdió dos muestras positivas (1.22%) de la muestra total. Esto puede tener grandes implicaciones clínicas para la dinámica de la transmisión tanto a nivel de paciente como comunitario.
Otro análisis comparativo incluido en este estudio fue el ensayo Sansure Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (RUO); El porcentaje general del partido fue del 96.3%. La fuerza del acuerdo también fue determinada por el valor de Kappa de Cohen, que era 0.925, lo que indica un acuerdo total con el CRS. Una vez más, nuestros resultados son idénticos a los estudios realizados en la Universidad Central South en Changsha, China, y en el Departamento de Laboratorio Clínico del Hospital Popular de Liuzhou, Ciudad de Liuzhou, China17. A pesar de que se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo de biotecnología de sansura ha tenido una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (P <0.005). A pesar de que se registró la buena concordancia estadística anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de MacNemar) mostró que el resultado del ensayo de biotecnología de sansura ha tenido una diferencia estadísticamente significativa en comparación con CRS (P <0.005). НесесетрES на т, что ыло зиксирeno (критерий макнеífigo) показал, что резльетат аiguritar 0,005). Aunque se registró el buen acuerdo estadístico anterior, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró que el resultado del ensayo de biotecnología de Sansure tuvo una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el CRS (P <0.005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验（ Macnemar 检验）表明 ， Sansure Biotech 检测的结果与 CRS 相比具有统计学显着差异（ P <0.005 ）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（ Macnemar 检验 表明 ， ， Sansure Biotech 检测 结果 与 Crs 相比 具有 （（ （（ P <0.005 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））） Н н н нidamente о. статистически значиífigoю разницц (P <0,005) между анализом Sansure Biotech и CRS. A pesar del buen acuerdo estadístico mencionado anteriormente, la prueba de chi-cuadrado (prueba de McNemar) mostró una diferencia estadísticamente significativa (P <0.005) entre el ensayo de biotecnología de Sansure y el CRS.Se encontró que seis muestras (3.66%) eran falsos negativos en comparación con CRS (Tabla complementaria 1); Esto es muy importante, especialmente dada la dinámica de la transmisión del virus. Los datos anteriores también admiten esta baja tasa de detección15.
En este estudio, los valores de CT se determinaron para cada ensayo y plataforma respectiva, con el valor de CT medio más bajo reportado en el ensayo Abbott SARS-CoV-2. Este resultado puede estar relacionado con el sistema de prueba genética combinada simultánea de Abbott para la detección de SARS-CoV-2. Por lo tanto, según la Figura 1, el 87.6% de los resultados de Abbott SARS-CoV-2 tenían valores CT por debajo de 20. Solo un pequeño número de resultados de muestra (12.4%) estaban en el rango de 20-30. Los valores de CT por encima de 30 no se registraron. Además del uso de Abbott del formato de prueba genética del panel SARS-CoV-2, este resultado puede estar relacionado con el límite de detección más bajo (32.5 copias de ARN/ml) 18, que es tres veces más bajo que el límite inferior de la compañía de 100 copias/ml de ARN. ml) 19.
Este estudio tiene algunas limitaciones: en primer lugar, no tenemos métodos estándar/de referencia [como carga viral u otras pruebas de laboratorio (LDA)] debido a la falta de recursos. En segundo lugar, todas las muestras utilizadas en este estudio fueron hisopos nasofaríngales, mientras que los resultados no fueron aplicables a otros tipos de muestras, y tercero, el tamaño de nuestra muestra era pequeño.
Este estudio comparó el rendimiento de cuatro ensayos RRT-PCR para SARS-CoV-2 utilizando muestras nasofaríngeas. Todos los ensayos de detección tuvieron un rendimiento casi comparable, con la excepción del ensayo de biotecnología de Sansure. Además, la baja tasa de positividad se identificó en el ensayo de biotecnología de Sansure en comparación con el CRS (P <0.05). Además, la baja tasa de positividad se identificó en el ensayo de biotecnología de Sansure en comparación con el CRS (P <0.05). Кр° м т, в тесте Sansure Biotech ыл выascлн низкий процент полололите razón Además, la prueba de biotecnología de Sansure mostró un bajo porcentaje de resultados positivos en comparación con CRS (P <0.05).此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0.05)。此外 ， 与 CRS 相比 ， Sansure Biotech 检测的阳性率较低 (P <0.05)。 Кроueve того, анализ Sansure Biotech им болеE низкий уровень положите razón Además, el ensayo de biotecnología de Sansure tenía una tasa de positividad más baja en comparación con CRS (P <0.05).El análisis de Sansure Biotech NCOV-2019 (RUO) de PPA, NPA y acuerdo general excedió el 93.5% con un valor de resistencia de acuerdo de acuerdo de 0.925. Finalmente, el ensayo de biotecnología de Sansure (RUO) necesita una validación adicional para su uso en Etiopía, y se debe considerar investigaciones adicionales para evaluar las reclamaciones de fabricantes individuales.
El diseño del estudio comparativo se realizó en cuatro centros de salud en Addis Abeba, el Hospital Eka Kotebe, el Centro de Tratamiento de la Iglesia Millennium, el Hospital Zewooditu Memorial y el Hospital de Especialistas en Tuberculosis de St. Peter. Los datos se recopilaron entre el 1 y el 31 de diciembre de 2020. Las instalaciones médicas para este estudio fueron elegidas a propósito en función de su gran número de casos y la disponibilidad de centros de tratamiento importantes en la ciudad. Del mismo modo, los instrumentos, incluidos los instrumentos de PCR en tiempo real ABI 7500 y Abbott M2000, se seleccionaron de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes de reactivos NAAT, y se seleccionaron cuatro kits de detección de PCR para este estudio, ya que la mayoría de los laboratorios en Etiopía usaron al menos al menos cuatro de ellos. Prueba de genes, prueba de Abbott SARS-CoV-2, prueba de biotecnología de Sansure y prueba BGI SARS-CoV-2 realizada durante el estudio).
Las pruebas de SARS-CoV-2 se realizaron del 1 al 30 de diciembre de 2020 utilizando 3 ml de medio de transporte viral (VTM) (Tecnología Miraclean, Shenzhen, China) de individuos bajo investigación de Covid-19 se refirió a Ephi. Las muestras nasofaríngeas fueron recolectadas por coleccionistas de muestra entrenados y se enviaron a Ephi en paquetes triples. Antes del aislamiento del ácido nucleico, a cada muestra se le asigna un número de identificación único. La extracción se realiza a partir de cada muestra inmediatamente después de la llegada utilizando métodos de extracción manual y automática. Por lo tanto, para la extracción automática de Abbott M2000, se extrajeron 1,3 ml (incluido 0,8 ml de volumen muerto y un volumen de entrada de extracción de 0,5 ml) de la muestra y se pasó a través del sistema de preparación de muestra de ADN de Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EE. UU.). ) Se incluyó un lote de 96 [92 muestras, dos controles de detección y dos controles no de plantilla (NTC)] en el proceso general (recuperación y detección) de dos rondas de SARS-CoV-2 (EUA) en tiempo real. minería. Del mismo modo, para la extracción manual, use las mismas muestras (para extracción automática y descubrimiento). Por lo tanto, durante todo el proceso, se aliquotaron y extrajeron muestras de 140 µl utilizando el mini kit de ARN viral Qiaamp (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) en lotes de 24 (incluidas 20 muestras, dos controles de ensayo y dos NTC) en nueve rondas. Los eluados extraídos manualmente se amplificaron y se detectaron usando un ciclador térmico ABI 7500 utilizando el ensayo SARS-CoV-2 BGI, el ensayo de genes DAAN y el ensayo de biotecnología de Sansure.
El aislamiento automatizado y la purificación del ARN viral SARS-CoV-2 siguen el principio de cuentas magnéticas utilizando reactivos de preparación de la muestra de ADN de Abbott. La inactivación de muestras y la solubilización de partículas virales se lleva a cabo utilizando un detergente que contiene isotiocianato de guanidina para desnaturalizar la proteína e inactivar ARNasa. Luego, el ARN se separa de la proteína mediante separación de fase sólida usando sílice, es decir, la sal de guanidinio y el pH alcalino del tampón de lisis promueven la unión de los ácidos nucleicos a la sílice (SIO2). El paso de enjuague elimina las proteínas y los desechos restantes para producir una solución clara. El ARN transparente se aísla de las micropartículas basadas en sílice utilizando el campo magnético del instrumento20,21. Por otro lado, el método de columna de columna de giro se lleva a cabo aislamiento manual de ARN mediante el método de columna de giro utilizando centrifugación en lugar de un soporte magnético y separación de micropartículas del eluyente.
La prueba de detección SARS-CoV-2 en tiempo real de Abbott (Abbott Molecular, Inc.) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que recibió EUA19,22 de la OMS y la FDA. En este protocolo, la inactivación de la muestra antes de la extracción se realizó en un baño de agua a 56 ° C durante 30 minutos. Después de la inactivación del virus, la extracción de ácido nucleico se realizó en un instrumento Abbott M2000 SP de 0,5 ml de VTM usando un sistema de preparación de muestra de ADN Abbott M2000. Según el fabricante. La amplificación y la detección se realizaron utilizando un instrumento RT-PCR Abbott M2000, y se realizó una detección dual para los genes RDRP y N. Rox) y Vic P (tinte patentado) para la orientación y detección de controles internos, lo que permite la detección simultánea de ambos productos de amplificación 19.
El método de detección de amplificación de este kit se basa en la tecnología RT-PCR de un solo paso. Los genes ORF1A/B y N fueron seleccionados como regiones conservadas por la tecnología de genes DAAN para detectar la amplificación de la región objetivo. Los cebadores específicos y las sondas fluorescentes (sondas de genes N marcadas con FAM, sondas ORF1A/B marcadas con VIC) se han diseñado para detectar ARN SARS-CoV-2 en muestras. Las mezclas finales de eluyente y maestra se prepararon agregando 5 µl de eluent a 20 µl de la mezcla maestra a un volumen final de 25 µl. La amplificación y la detección se realizaron simultáneamente en un instrumento de PCR en tiempo real ABI 750024.
Los genes ORF1A/B y N se detectaron utilizando el kit de diagnóstico de ácido nucleico Sansure Biotech NCOV-2019 (detección de PCR fluorescente). Prepare sondas específicas para cada gen objetivo seleccionando el canal FAM para la región ORF1A/B y el canal ROX para el gen N. A este kit de ensayo, se agregan reactivos de mezcla eluent y maestro de la siguiente manera: prepare 30 µl de reactivo de mezcla maestra y una muestra eluida de 20 µl para detección/amplificación. La PCR en tiempo real ABI 750025 se utilizó para la amplificación/detección.
La prueba BGI SARS-COV-2 es un kit RRT-PCR en tiempo real fluorescente para el diagnóstico de CoVID-19. La región objetivo se encuentra en la región ORF1A/B del genoma SARS-CoV-2, que es un solo método de detección de genes. Además, el gen de la limpieza humano β-actina es un gen objetivo regulado internamente. La mezcla maestra se prepara mezclando 20 µl del reactivo de mezcla maestra y 10 µl de la muestra de ARN extraída en una placa de pozo26. Se usó un instrumento de PCR cuantitativo fluorescente de ABI 7500 para la amplificación y detección. Toda la amplificación del ácido nucleico, las condiciones de ejecución de PCR para cada ensayo y la interpretación de los resultados se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante respectivo (Tabla 3).
En este análisis comparativo, no utilizamos el método estándar de referencia para determinar el porcentaje de acuerdo (positivo, negativo y en general) y otros parámetros de comparación para los cuatro análisis. Cada comparación de la prueba se realizó con CRS, en este estudio el CRS fue establecido por la regla "cualquier positivo" y se determinó el resultado, no por una sola prueba, utilizamos al menos dos resultados de prueba coincidentes. Además, en el caso de la transmisión CoVID-19, los resultados falsos negativos son más peligrosos que los resultados falsos positivos. Por lo tanto, para decir "positivo" con la mayor precisión posible de un resultado de CRS, al menos dos pruebas de ensayo deben ser positivas, lo que significa que es probable que al menos un resultado positivo provenga de un ensayo de la UEA. Por lo tanto, de los cuatro resultados de las pruebas, dos o más resultados de las pruebas que dan el mismo resultado se consideran verdaderos positivos o negativos18,27.
Los datos se recopilaron utilizando formularios de extracción de datos estructurados, la entrada y el análisis de datos se realizaron utilizando el software estadístico de Excel y la versión 23.0 de SPSS para estadísticas descriptivas. Se analizaron un acuerdo de porcentaje positivo, negativo y general, y se usó una puntuación Kappa para determinar el grado de acuerdo de cada método con CRS. Los valores de Kappa se interpretan de la siguiente manera: 0.01 a 0.20 para un acuerdo leve, 0.21 a 0.40 para un acuerdo general, 0.41-0.60 para un acuerdo moderado, 0.61-0.80 para un acuerdo importante y 0.81-0.99 para el acuerdo completo28.
La autorización ética se obtuvo de la Universidad de Addis Abeba y todos los protocolos experimentales para este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión de Ética Científica del Instituto de Salud Pública de Etiopía. El número de referencia para la licencia de ética de Ephi es EPHI/IRB-279-2020. Todos los métodos se aplicaron de acuerdo con las recomendaciones y disposiciones de las pautas integrales nacionales de Etiopía para el tratamiento de CoVID-19. Además, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes del estudio antes de participar en el estudio.
Todos los datos obtenidos o analizados en este estudio se incluyen en este artículo publicado. Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles del autor respectivo a solicitud razonable.
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